《Analytica Chimica Acta》：Plasmonic gold nanocube-enhanced SERS biosensor based on INDEBT and click chemistry coupled with exonuclease III-assisted cycling amplification for sensitive detection of ribonuclease H activity
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表面增强拉曼散射（SERS）生物传感器通过集成 instant dehydration in butanol（INDEBT）纳米标签制备、铜免 click 化学连接及 Exo III 增幅策略，实现 RNase H 活性高灵敏度检测（LOD 3.89×10?? U/μL）。方法解决了传统盐老化学法时效长、纳米颗粒聚集等问题，并成功应用于真实细胞提取检测。
朱彩莲|朱书娇|孙建军|吴少华
中国福建省福州市福州大学化学学院，食品安全与生物学分析科学教育部重点实验室，福建省食品安全分析与检测技术重点实验室，350108
摘要
核糖核酸酶H（RNase H）广泛参与DNA复制、RNA转录和DNA修复等关键生物过程，并逐渐成为多种疾病的重要治疗靶点。本研究开发了一种基于等离子体金纳米立方体增强表面增强拉曼散射（SERS）的生物传感器，通过同时结合丁醇中的即时脱水（INDEBT）技术制备SERS标签、无铜点击化学技术进行SERS标签偶联以及外切核酸酶III（Exo III）辅助的目标循环扩增，实现了对RNase H活性的高灵敏度检测。INDEBT方法简化了SERS标签的制备过程并提高了效率。此外，点击化学技术用于将SERS标签偶联到生物传感平台上，避免了先前研究中DNA杂交所需高盐缓冲液导致的纳米粒子聚集问题。AuNCs的尖锐几何结构有效增强了SERS效应，而Exo III辅助的循环扩增策略显著提高了检测灵敏度。在优化实验条件下，该方法表现出高灵敏度和良好的选择性，检测限（LOD）达到3.89×10?7 U μL?1，低于文献中的大多数报道值。该方法已成功应用于实际细胞提取物中RNase H活性的检测。
引言
表面增强拉曼散射（SERS）是一种强大的光谱分析工具，广泛应用于癌症标志物[1]、环境污染物[2]和核酸[3]的检测。SERS的信号增强主要依赖于SERS活性材料的局部表面等离子体共振（LSPR）效应以及分析物与基底之间的相互作用[4]。已开发出多种SERS活性基底，包括金纳米球[5]、金纳米棒[6]、金纳米星[7]和金纳米三角形[8]。其中，金纳米立方体（AuNCs）因其通过尖锐边缘和角产生的“避雷针效应”能够显著增强SERS性能，并具有良好的化学稳定性[10]而受到关注。
RNase H（核糖核酸酶H）是由Stein和Hausen于1969年发现的内源性核糖核酸酶家族成员[11]。该酶特异性地水解DNA-RNA双链中的磷酸二酯键，存在于从古菌和原核生物到真核生物的几乎所有生物体中。它广泛参与DNA复制、RNA转录和DNA修复等关键生物过程[12,13]。其活性异常与某些疾病甚至癌症的发展有关。值得注意的是，作为HIV-1逆转录酶的核心功能域，RNase H参与了逆转录过程[14]。鉴于其在病毒复制中的关键作用，RNase H被视为抗HIV治疗的新靶点[15]。因此，检测RNase H活性对于早期疾病诊断和致病机制研究具有重要意义。传统的RNase H检测方法（如复性凝胶测定[16]、毛细管电泳[17]和酶联免疫吸附测定[18]）存在程序耗时、成本高和灵敏度不足等问题，限制了其广泛应用。尽管后续开发的荧光[19]、化学发光[20]和比色[21]测定方法具有便利性和快速性等优点，但其分析性能仍有提升空间。因此，仍需开发一种高灵敏度的RNase H检测策略。
已开发出多种信号放大策略以提高检测灵敏度，包括杂交链反应[22]、滚环扩增[23]和核酸酶辅助信号放大[24]。其中，外切核酸酶III（Exo III）辅助的信号放大因其简单高效而受到关注。Exo III是一种序列无关的核酸酶，可选择性地水解双链DNA（dsDNA）的凹陷或平钝3′-羟基末端，对dsDNA或单链DNA（ssDNA）的3′-羟基突出末端几乎没有活性[25,26]。利用这些特性，Exo III被广泛用于生物传感策略的开发。
最近，丁醇中的即时脱水（INDEBT）技术用于高效制备高密度DNA修饰纳米粒子，引起了广泛关注[27]。该技术可在几秒内完成，显著提高了DNA链在金纳米粒子（AuNPs）表面的负载密度。具体而言，INDEBT过程将DNA/AuNPs体系中的水分提取到丁醇相中，减少了DNA/AuNPs的可用空间，克服了空间和静电障碍，从而加速了DNA通过Au–S键在Au纳米粒子上的锚定。
2002年，Sharpless及其同事首次报道了一种新型反应——铜(I)催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）。由于其高效性和温和的反应条件，该反应被称为点击化学[28]。随后，Bertozzi等人在2004年开发了一种无铜点击化学策略，即应变促进的叠氮-炔环加成（SPAAC）[29]。近年来，由于其快速动力学、高效率、操作简便性、优异的区域选择性和广泛应用性，这项技术已在生物传感领域得到广泛应用[30,31]。例如，Ye团队利用无铜点击化学构建了一种超灵敏的光电化学传感器，成功检测到了超低浓度的微RNA[32]；Hao研究小组则通过叠氮修饰的病毒颗粒与二苯并环辛炔（DBCO）功能化量子点的点击偶联实现了包膜病毒的荧光标记[33]。
我们团队此前构建了多种基于等离子体纳米粒子增强的SERS生物传感平台[34,35]。在这些研究中，我们采用了盐老化方法制备SERS标签。盐老化的主要目的有两个方面：一是确保AuNPs上加载足够的DNA量；二是通过DNA杂交将SERS标签结合到SERS传感平台上，这需要具有一定离子强度的缓冲液。如果SERS标签未经盐老化处理，在后续暴露于DNA杂交所需的高盐缓冲液时容易发生聚集。然而，这种盐老化方法需要较长时间（数小时至数天）才能完成。
为解决这些限制，我们结合了INDEBT技术的快速SERS标签合成优势和无铜点击化学技术，无需依赖缓冲液的离子强度即可将SERS标签偶联到传感器表面。首先，INDEBT方法比盐老化方法更简单高效（约1小时），具有较高的重复性和稳定性；其次，采用DBCO和叠氮（N3）基团的SPAAC点击化学策略在温和条件下选择性地将SERS标签附着到传感器表面，消除了先前研究中DNA杂交方法所需的高盐缓冲液的需求。这两种策略有效防止了纳米粒子聚集，显著提高了传感器构建的效率和便利性。最后，AuNCs的优异SERS增强性能和Exo III辅助的循环扩增策略显著提高了所提出的SERS生物传感器对RNase H的检测灵敏度。检测限（LOD）为3.89×10?7 U μL?1，低于大多数文献报道的值。总之，本研究为RNase H活性检测提供了一种新方法，具有扩展到其他生物医学研究和早期临床诊断的潜力。
试剂和仪器
RNase H和Exo III购自New England Biolabs Inc.（北京，中国）。Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、tris-borate-EDTA（TBE）缓冲液、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）、甘油（>99.5%）、DEPC处理的水、丙烯酰胺（30%）和胎牛血清（FBS）购自Sangon Biotech（上海，中国）。RNase H ELISA试剂盒购自上海酶联生物技术有限公司（上海，中国）。其他试剂详见ESI。
所有寡核苷酸
RNase H检测用SERS传感器的原理
所提出的RNase H活性检测SERS传感器的构建原理如图1所示。传感器构建主要包括三个部分：SERS标签的组装、Exo III辅助的信号放大过程以及SERS基底的组装。SERS标签的组装：信号探针S2和拉曼信号分子4-MBA通过Au–S键结合到AuNCs表面，形成AuNCs/4-MBA/S2 SERS标签。
结论
总结来说，本研究提出了一种基于等离子体金纳米立方体（AuNCs）增强的SERS生物传感器，通过结合INDEBT技术制备SERS标签、无铜点击化学和Exo III辅助的循环扩增技术，实现了RNase H活性的检测。SERS标签中的AuNCs基底提供了高质量的SERS“热点”，显著增强了4-MBA的SERS信号。INDEBT方法简化了SERS标签的制备过程。无铜点击化学技术的应用进一步提高了检测灵敏度。
CRediT作者贡献声明
朱彩莲：数据整理、研究、验证、初稿撰写。朱书娇：数据整理、撰写、审稿与编辑。孙建军：撰写、审稿与编辑。吴少华：概念构思、数据整理、资金获取、方法设计、项目管理、监督、撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：21575026）和长江学者和创新研究团队计划（项目编号：IRT_15R11）的财政支持。
