将DNA四面体与亲和磁性悬浮技术相结合，用于选择性捕获和灵敏检测循环肿瘤细胞

《Analytica Chimica Acta》：Integrating DNA tetrahedron with affinity magnetic levitation for selective capture and sensitive detection of circulating tumor cells

通过aptamer修饰的DNA四面体（TDN）与微球结合，构建了基于磁悬浮分离的高效CTC检测平台，检测限达8.81 cells/mL，重复性误差小于4.48%。

　　

张子龙|孙思迪|袁玉轩|林玉金|曹一涛|陈银子|张静|王静|赵新峰

中国教育部西部资源生物学与生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院，陕西西安，710069

摘要

循环肿瘤细胞（CTC）是早期癌症诊断和治疗反应评估的可靠生物标志物。这需要不断尝试开发新的方法来检测CTC，这些方法应具有高度富集和抗干扰的能力。在此，我们通过结合适配体介导的特异性识别和亲和磁悬浮（Maglev）技术，构建了一个简单的CTC检测平台。该方法包括使用SYL3C适配体修饰DNA四面体（TDN）作为“触手”，通过叠氮-炔烃点击化学将适配体偶联到微球上，利用活化微球富集CTC，最后通过亲和磁悬浮技术检测CTC。这种设计使适配体传感器类似于章鱼的触手，从而提高了CTC的捕获选择性和效率。一旦捕获到CTC，就会形成微球@TDN@CTC复合物，导致整体密度发生变化。通过测量CTC结合前后微球的悬浮高度差来计算CTC的数量。在MCF-7细胞上的示例研究中，检测到每毫升8.81个CTC，重复性相对标准偏差小于4.48%；而在模拟临床样本中，检测到每毫升9.08个CTC，相对标准偏差为6.98%。对模拟临床样本的分析表明，该方法能够有效检测CTC，并且对血浆中存在的其他物质具有很强的抗干扰能力。一旦进行大量临床试验，该方法有可能成为临床相关癌症的早期诊断工具。

引言

恶性肿瘤是全球主要的健康威胁，超过90%的死亡病例与肿瘤转移有关。循环肿瘤细胞（CTC）是从原发或转移性肿瘤组织脱离并进入外周血液循环的罕见细胞。它们携带肿瘤的核心生物学特征，是肿瘤转移的关键参与者[1]、[2]、[3]。因此，CTC成为早期癌症诊断和治疗效果评估的可靠生物标志物。传统的检测方法如影像学检查和组织活检往往具有侵入性且采样有限[4]。因此，开发敏感高效的CTC检测方法受到了各个领域的广泛关注。

通常情况下，血浆中的CTC数量极少，而血液细胞和蛋白质的数量远多于CTC。这使得CTC的捕获和富集面临巨大挑战，因为这些共存物质常常会产生严重的干扰[5]、[6]。为此，过去几十年中成功开发了基于抗原-抗体相互作用的免疫磁珠来捕获CTC。然而，这种方法的主要局限性在于捕获效率不稳定、假阳性结果较多，以及难以在试点规模上制备出具有可重复性和稳定活性的抗体[7]、[8]。最近的研究转向了通过密度或大小对CTC进行初步富集和分离的方法。但这种方法受到正常血细胞数量较多和CTC纯度相对较低的限制[9]、[10]。作为替代方案，人们开发了基于免疫亲和原理的微流控芯片，用于选择性捕获CTC并利用物理性质进行分离。尽管这些芯片集成了捕获和检测步骤，但由于制造复杂和样本处理通量低，其应用受到限制[11]、[12]、[13]。因此，亟需开发具有高捕获选择性、高检测灵敏度和操作简便性的CTC分析方法。

在亲和相互作用中，适配体被证明能够以高亲和力特异性结合任何目标物质，包括活细胞、蛋白质甚至小分子[14]、[15]、[16]。这一特性使它们成为从复杂基质中捕获特定目标的抗体替代品。此外，将适配体引入DNA纳米结构的设计中可以进一步提高对目标的结合选择性。在这种情况下，DNA四面体（TDN）是最常用的结构，因为它：1）合成简单，具有三维刚性结构且体积小；2）比单链DNA更稳定，因为难以被核酸酶识别和切割；3）允许在每条链的表面或末端高度有序地组装多个识别单元，从而提供多种识别单元和与多种目标分子结合的位点[17]、[18]、[19]、[20]。综合这些优势，一旦将适配体和TDN结合到检测方法中，有望提出一种高选择性和高效的CTC捕获方法。

作为一种简单、快速、低成本的方法，磁悬浮（Maglev）已被证明是检测目标细胞的有效途径。通过Maglev技术，可以根据分析物的密度和磁化率对其进行选择性富集和灵敏检测[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。成功的案例包括在单细胞水平上区分SH-SY5Y细胞的分化程度[27]。在我们之前的研究中[28]，我们提出了亲和磁悬浮（affinity Maglev）的概念，并报道了一种用于筛选和检测DNA编码文库（DELs）的新策略。我们已经证明，亲和捕获能力和Maglev分离技术的结合可以实现对复杂基质中DNA-药物缀合物的选择性富集和灵敏检测。基于这些结果，我们假设如果在方法开发过程中能够实现CTC的选择性捕获，就有可能提供一种用于血浆中CTC的可视化检测方法。

为了验证上述假设，本研究尝试使用SYL3C适配体作为“触手”来修饰TDN的末端。随后通过叠氮-炔烃点击化学将修饰后的TDN组装到微球表面，形成类似章鱼触手的适配体传感器，以提高CTC的捕获选择性和效率。捕获到CTC后，会形成微球@TDN@CTC复合物，导致整体密度变化，进而引起Maglev系统中悬浮高度的变化，从而可以通过简单的距离测量计算CTC的数量。我们发现该方法能够在不受共存物质干扰的情况下从血浆中捕获CTC，检测限低至每毫升8.81个CTC。该方法的重复性良好，相对标准偏差小于4.48%。基于这些结果，我们认为该方法有可能成为临床CTC检测的替代方法。一旦进行大量临床试验，它有可能成为临床相关癌症的早期诊断工具。

材料与仪器

单链DNA（表S1）由General Biol（中国安徽）合成。MCF-7（SNL-060）、MDA-MB-231（SNL-073）、MCF10A（SNL-225）细胞系及其相应的培养基购自武汉Sunncell Biotechnology Co., Ltd（中国武汉）。Cell-Tracker? Green CMFDA来自Beyotime Biotech Inc（中国上海）。CellTrace? Red荧光探针来自Yeasen Biotechnology Co., Ltd（中国上海）。氨基微球（300μm）来自Suzhou Knowledge & Benefit Sphere Tech。

亲和磁悬浮系统的优化

如先前文献[22]所述，MagLev系统中分析物的悬浮由方程式（1）、（2）描述。根据这些方程式，MagLev系统中的悬浮高度由磁场强度（B₀）、密度差（ρ_s - ρ_m）和磁化率差（χ_s - χ_m）决定。下标s表示样品，m表示顺磁介质。磁场强度与磁铁及其之间的距离密切相关。

结论

本研究提出了一种高灵敏度的亲和磁悬浮系统用于检测CTC。该方法利用适配体锚定的TDN结构，对目标CTC具有很高的选择性和稳定性。在MCF-7细胞上的示例研究中，检测到每毫升8.81个CTC，重复性相对标准偏差小于4.48%；而在模拟临床样本中，检测到每毫升9.08个CTC，相对标准偏差为6.98%。对模拟临床样本的分析表明……

CRediT作者贡献声明

张静：研究工作、资金获取。王静：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。曹一涛：验证、研究。陈银子：验证、研究。袁玉轩：验证、研究。林玉金：撰写、审稿与编辑、研究。张子龙：撰写初稿、验证、方法学设计、研究、数据分析、数据管理。孙思迪：撰写、审稿与编辑、方法学设计、研究。赵新峰：资金支持

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文研究的个人关系。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（编号22374116、42302343）和云南特色植物提取实验室（编号YKKF2023010）的财政支持。