基于荧光偏振的高通量筛选方法能够识别出与猴痘病毒N7-甲基转移酶具有竞争性的抑制剂

《Antiviral Research》：Fluorescence polarization–based high-throughput screening identifies SAM-competitive inhibitors of monkeypox virus N7-methyltransferase

猴痘病毒（MPXV）N7-甲基转移酶（N7-MTase）是RNA成熟的关键酶，本研究开发荧光偏振（FP）高通量筛选平台，发现多种SAM竞争性抑制剂，可抑制MPXV及牛痘病毒（VACV）的N7甲基化，在细胞实验中非细胞毒性浓度下抑制VACV复制，并作用于病毒基因表达后期阶段。

　　

徐峰|陈永康|刘澈|胡立媛|陈可欣|魏慧敏|童英璐|廖家玲|徐峰|吴一鹤|张蓉|谢伟

中国浙江大学药学院，杭州，310058

摘要

猴痘病毒（MPXV）编码自身的RNA加帽机制，这一机制对病毒RNA的成熟、有效复制以及逃避宿主先天免疫至关重要。然而，针对MPXV RNA加帽的抗病毒潜力在很大程度上尚未得到探索，部分原因是缺乏可靠的生化检测方法和经过验证的抑制剂。在这里，我们报道了一种基于荧光偏振（FP）的高通量筛选（HTS）方法，该方法能够直接测量S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）与MPXV N7-甲基转移酶（N7-MTase）复合物的竞争性结合。使用荧光SAM类似物FL-NAH，我们优化了检测条件，并证明了该方法具有较高的信噪比、对二甲基亚砜（DMSO）和去污剂的强耐受性，以及能够被已知的甲基转移酶抑制剂有效竞争性置换。将该方法应用于一个FDA批准的药物库的初步筛选中，发现了几种具有低微摩尔效力的SAM竞争性抑制剂。随后对一个包含10,000种化合物的结构多样化库进行筛选，得到了多种能够在生化实验中直接抑制MPXV和牛痘病毒（VACV）N7-MTase催化的N7-甲基化的化合物。选定的化合物在非细胞毒性浓度下能够降低VACV的产量。添加时间分析以及复制缺陷的MPXV系统进一步表明，这些抑制剂作用于病毒进入细胞后的阶段，并干扰病毒基因表达。总体而言，本研究建立了一个基于FP的高通量筛选平台，用于发现MPXV N7-MTase的SAM竞争性抑制剂，并为研究痘病毒RNA加帽作为抗病毒干预的目标提供了化学探针和先导化合物。

引言

猴痘病毒（MPXV）是一种属于痘病毒科（Poxviridae）正痘病毒属（Orthopoxvirus）的包膜双链DNA病毒，该科还包括天花病毒（VARV）、牛痘病毒（VACV）和牛痘病毒（CPXV）（Gessain等人，2022年）。MPXV包含两个主要的进化分支：I分支与4-11%的死亡率相关，而II分支通常导致较轻的疾病（Dimitrakoff，2022年；Van Dijck等人，2023年）。2022年IIb分支的全球出现以及随后Ib分支的传播，导致世界卫生组织（WHO）多次宣布公共卫生紧急事件（PHEIC）（Otu等人，2022年；Du等人，2024年）。目前，治疗猴痘最常用的抗病毒药物是西多福韦和特科维拉马特（Bojkova等人，2023年；Lanier等人，2025年；Rizk等人，2022年；Siegrist和Sassine，2023年）。西多福韦是一种核苷酸类似物，作用于病毒DNA聚合酶，具有广谱抗病毒活性（De Clercq，2002年；McCarty等人，2025年）。然而，其临床应用受到显著的肾毒性和安全问题的限制（Farlow等人，2010年）。特科维拉马特作用于病毒包膜蛋白F13，以限制病毒在细胞间的传播（Chen等人，2009年；Duraffour等人，2015年；Husain和Moss，2001年；Russo等人，2021年；Vernuccio等人，2025年）；然而，最近的临床试验在某些患者群体中未能证明其优于安慰剂的疗效（The PALM007写作组，2025年；Zucker等人，2026年），并且已经报告了耐药变体（DeLaurentis等人，2022年；Frenois-Veyrat等人，2022年；Lenharo，2024年；Smith等人，2023年）。这些挑战突显了迫切需要识别MPXV复制周期中的新可成药靶点（Ding等人，2025年；Gao等人，2025年；Lanier等人，2025年；Wang等人，2025年）。

病毒RNA加帽对于转录本稳定性、高效翻译以及逃避宿主先天免疫至关重要（Both等人，1975年；Chen等人，2024年；Decroly等人，2011年；Parnian等人，2024年；Paterson和Rosenberg，1979年；Shuman，2015年；Thoresen等人，2021年）。作为细胞质DNA病毒，MPXV编码自身的加帽机制（De La Pe?a等人，2007年；Hillen等人，2019年；Kyrieleis等人，2014年）。病毒的E1和E12蛋白形成一个异二聚体复合物，催化连续的反应：RNA三磷酸酶、鸟苷酰转移酶和鸟嘌呤-N7甲基转移酶（N7-MTase）。这一过程在病毒mRNAs的5′端生成cap-0结构（m⁷GpppN，其中N表示第一个转录的核苷酸）（De La Pe?a等人，2007年；Hillen等人，2019年；Kyrieleis等人，2014年）。这个中间产物进一步被病毒的2′-O-甲基转移酶VP39转化为cap-1（Hodel等人，1996年；Silhan等人，2023年；Skvara等人，2023年；Zgarbová等人，2023年；Züst等人，2011年）。在这个过程中，E1亚基的C末端结构域与E12结合形成E1_CTD/E12复合物，作为病毒的N7-MTase（A. Chen等人，2024年；De La Pe?a等人，2007年；Fabrega等人，2004年；Wang等人，2023年；Zheng和Shuman，2008年）。从结构上看，E1_CTD包含一个用于甲基捐赠的S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）结合口袋和一个用于RNA底物的帽结合口袋（图1B）。这些特征与人类甲基转移酶有所不同（A. Chen等人，2024年；Wang等人，2023年），为选择性抑制提供了机会。

病毒N7-MTase最近成为有前景的抗病毒靶点，这从成功鉴定出SARS-CoV-2 NSP14抑制剂中得到了证明（Luo等人，2025年；Meyer等人，2025年）。相比之下，针对MPXV N7-MTase的抗病毒潜力在很大程度上尚未得到探索（Hashim等人，2025年；Waqas等人，2025年），部分原因是缺乏可靠的生化检测方法。荧光偏振（FP）检测方法是高通量筛选（HTS）的强大工具（Karimian Shamsabadi和Jia，2024a，2024b；Lea和Simeonov，2011年；Leissring等人，2003年；Rossi和Taylor，2011年；Zhang等人，2025年）。荧光SAM类似物FL-NAH已被证明能有效探测其他病毒MTase中的SAM结合位点，例如黄病毒NS5（Samrat等人，2023a，2023b）。在这个系统中，FL-NAH的结合可以被高亲和力的配体竞争性置换，从而直接评估目标分子的结合情况。然而，这种策略是否可以应用于MPXV E1/E12复合物以进行基于HTS的SAM竞争性抑制剂发现，仍有待确定。

在这里，我们建立并优化了一种基于FL-NAH的FP检测方法用于MPXV N7-MTase，并验证了其适用于HTS。该检测方法表现出高灵敏度、对DMSO/去污剂的强耐受性以及清晰的置换动力学。通过筛选一个FDA批准的药物库和一个包含10,000种化合物的多样化库，我们发现了几种能够与SAM结合口袋结合并抑制MPXV和VACV N7-MTase催化的N7-甲基化的化合物。选定的化合物在非细胞毒性浓度下能够降低VACV的产量。作用机制研究进一步表明，这些抑制剂主要干扰病毒基因表达和传染性子代的产生。这项工作为开发针对痘病毒RNA加帽的特异性抑制剂提供了一个稳健的HTS平台和化学先导化合物。

部分内容

蛋白质表达和纯化

编码MPXV E1_CTD（545至844个氨基酸）和E12（1至287个氨基酸）以及VACV D1_CTD（545至844个氨基酸）和D12（1至287个氨基酸）的密码子优化基因（序列见补充表1）在Sangon Biotech（中国）合成，并克隆到含有N末端His₆-SUMO标签的pRSFDuet-1载体（Novagen）中。蛋白质在E.coli BL21(DE3）中表达。细胞在37 °C下培养至OD₆₀₀ = 0.6，然后在18 °C下用0.2 mM IPTG诱导18小时。收获的细胞重新悬浮

MPXV N7-MTase荧光偏振检测方法的开发

为了建立MPXV N7-MTase的荧光偏振检测方法，我们使用了FL-NAH，一种荧光SAM（S-腺苷-L-甲硫氨酸）类似物（图1C）（Samrat等人，2023a，2023b）。结合实验在30 nM FL-NAH存在下使用重组MPXV E1_CTD/E12进行。随着N7-MTase浓度的增加，荧光偏振信号急剧上升，达到大约300 △mP的平台值（图1D）。FL-NAH的解离常数（K_D）被确定为32 ± 3 nM。

讨论

MPXV E1/E12复合物的N7-MTase活性是正痘病毒中一个有吸引力且保守的抗病毒靶点，但此前该领域缺乏一种能够直接定量测量其SAM结合口袋配体结合的生化方法。在这项研究中，我们通过使用SAM竞争性荧光探针FL-NAH建立了一个稳健的荧光偏振平台，从而填补了这一方法学空白。

CRediT作者贡献声明

徐峰：资源提供、方法学设计。廖家玲：资源提供、实验研究。童英璐：资源提供、实验研究。魏慧敏：资源提供、实验研究。陈可欣：资源提供、实验研究。胡立媛：可视化处理、方法学设计、实验研究。刘澈：可视化处理、软件开发、方法学设计。陈永康：撰写——审稿与编辑、可视化处理、方法学设计、实验研究、数据整理。谢伟：撰写——审稿与编辑、可视化处理、项目监督、方法学设计、资金管理

未引用的参考文献

Chen等人，2024年；Chen等人，2024年；The PALM007写作组，2025年。

数据可用性

支持本研究所有发现的数据均可在文章、其补充信息或源数据文件中找到。

手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了Google开发的Gemini工具来检查拼写和纠正语法。使用该工具/服务后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢中国科学院的张凯教授和浙江大学的滕鹏教授的帮助。我们感谢浙江大学生命科学研究所的核心设施提供的SPR支持。我们感谢浙江大学医学院的核心设施提供的技术支持。我们感谢西湖大学高通量核心设施的徐峰和金卫元。这项研究得到了国家自然科学基金（资助编号82473975和92569206）的支持。