《Biosensors and Bioelectronics》：Dual-site PGM-based point-of-care detection of EGFR exon 19 deletion with an endogenous internal control
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EGFR外显子19缺失（19del）的POCT检测平台通过FEN1酶促切割释放AMP，驱动葡萄糖消耗 каскад，利用商用个人葡萄糖监测仪（PGM）实现定量分析，并采用双位点设计（突变检测位点和内控位点）解决信号-off误判问题，灵敏度达27pM，突变分数检测下限0.44%，适用于细胞DNA和血清样本检测。
Hyo Won Jeon | Hyogu Han | Jieun Yang | Jun Ki Ahn
韩国大学生命科学与生物技术学院生物技术系，首尔02841，大韩民国
摘要
快速可靠地检测EGFR外显子19缺失（19del）对于非小细胞肺癌的精准治疗至关重要，然而目前的基因分型方法仍不适合用于即时检测（POCT）。在信号缺失的情况下，这一限制尤为明显，因为反应失败可能被误认为是真正的阴性结果。在这里，我们提出了一种基于双位点个人血糖仪（PGM）的读数平台，用于EGFR 19del的最低仪器化分析。在该系统中，目标依赖性 flap内切酶1（FEN1）的切割产生腺苷一磷酸（AMP），从而触发消耗葡萄糖的激酶级联反应，并能够使用商用PGM直接进行定量读数，而无需光学仪器或核酸扩增。为了提高可解释性，该平台通过由突变识别位点和保守控制位点组成的双位点设计来包含内源性内部对照，从而在确认样本充分性的同时，可靠地解释信号缺失的读数。该平台实现了约27 pM的检测限，并能在野生型/突变型混合物中区分出低至约0.44%的突变比例。其可行性进一步通过使用细胞来源的基因组DNA和含血清的样本得到了验证。这些结果表明，所提出的平台为分散式的EGFR 19del检测提供了一种可行且实用的方法。
引言
肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占绝大多数（约85%）（Cheng等人，2023；Melosky等人，2022）。在当前的精准肿瘤学领域，识别特定的遗传驱动因素不再是可选项，而是有效临床干预的关键要求（Chen等人，2023；Pesta等人，2022）。在这些改变中，表皮生长因子受体（EGFR）的突变非常常见，尤其是在亚洲人群中，其患病率可达到50%（Melosky等人，2022；Sharma等人，2007）。值得注意的是，EGFR外显子19缺失（19del）占这些激活突变的近一半，并且是预测对第一代和第二代酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）（包括吉非替尼和厄洛替尼）反应的重要生物标志物（Amann等人，2005；Tokudome等人，2020）。因此，快速准确地检测EGFR 19del对于优化治疗结果和提高患者生存率至关重要。
尽管EGFR 19del具有临床重要性，但其传统的检测金标准依赖于传统的组织活检，这种方法具有侵入性，通常受到肿瘤异质性的限制，并且难以重复进行（Martins等人，2021；Pesta等人，2022）。为了解决这些限制，基于血浆来源的循环肿瘤DNA（ctDNA）分析的液体活检作为一种非侵入性和纵向监测癌症进展的方法应运而生。然而，ctDNA在大量背景野生型DNA中以极低的浓度存在，需要高度敏感和特异性的检测方法（Alizadeh等人，2015；Hajishoreh等人，2024；Lee等人，2024；Pesta等人，2022；Tang等人，2020）。虽然像下一代测序（NGS）和定量聚合酶链反应（qPCR）这样的金标准技术具有高灵敏度，但它们对集中式实验室基础设施的严重依赖、高昂的成本和漫长的周转时间成为其在即时检测（POCT）应用中的关键障碍（Busser等人，2017；Chen和Zhao，2019；Mohammadian等人，2017；Tang等人，2020）。
为了克服这些限制，包括环介导等温扩增（LAMP）、链置换扩增（SDA）和催化发夹组装（CHA）在内的各种等温扩增技术因其在恒定温度下无需仪器的操作而受到关注，用于检测EGFR 19del（Kim等人，2018；Matsumoto等人，2018；Ren等人，2019；Wu等人，2024；Zou等人，2014）。然而，这些方法仍然依赖于专门的光学仪器进行荧光读数（Bae等人，2015；Choi等人，2010；Deng等人，2023）。更重要的是，许多这些检测方法采用“信号缺失”格式，其根本结构限制在于信号丢失无法区分目标缺失和系统故障（如核酸输入不足或扩增抑制）（Deng等人，2023）。鉴于临床样本中通常观察到的低变异等位基因频率（VAF），这一限制可能会影响突变型（MT）和野生型（WT）等位基因之间的可靠区分（Lamy等人，2020）。因此，迫切需要一种实用的POCT平台，该平台在满足低成本、快速周转和强大等位基因区分要求的同时，尽量减少仪器使用。在这种情况下，能够实现简单、无需设备的信号读数的检测策略对于真正的POCT实施特别有吸引力。
为了解决对非光学和用户友好读数系统的需求，最初用于简单血糖监测的个人血糖仪（PGMs）最近因其成本效益和广泛可用性而被重新用于非葡萄糖目标的多用途POCT平台。PGMs提供了一个独特优势，因为它们可以将生化反应转换为定量数字输出，而无需专门的实验室仪器（Ahn等人，2018；Han等人，2024, 2021；Jang等人，2026；Park等人，2022b, 2022a）。作为先驱，Xiang和Lu的研究小组提出了一种使用逆转酶-DNA结合物检测非葡萄糖目标的策略，该结合物在目标识别后释放，随后有报道称将其应用于多种生物标志物（Xiang和Lu，2012）。然而，大多数基于PGM的检测依赖于单一读数，仅反映目标驱动的反应，使得难以区分真正的目标依赖性信号变化和非特异性效应，如核酸输入不足、基质来源的抑制或酶促失败。因此，要将基于PGM的分子诊断扩展到POCT，需要一个同时验证样本充分性和反应有效性的内部质量控制功能。
基于我们之前建立的FEN1辅助级联酶反应（Jang等人，2026），我们在此报告了一种专门针对EGFR外显子19缺失检测的即时检测方法，使用个人血糖仪（PGM）进行定量读数。本研究的一个关键创新是引入了针对野生型（WT）和突变型（MT）等位基因之间保守的EGFR区域的内源性内部对照（IC），从而在整个检测过程中验证样本充分性和反应有效性。通过实施同时检测突变特异性位点和内部对照位点的双位点策略，所提出的系统即使在非常低的变异等位基因频率下也能可靠地解释结果。据我们所知，这是第一个集成内源性内部对照的基于PGM的EGFR突变检测平台，可以降低由于核酸输入不足或反应失败导致的假阴性或假阳性结果的风险。因此，这种双位点平台提供了一种简单、快速且仪器要求最低的解决方案，用于稳健的EGFR 19del检测，突显了其在分散式分子诊断和实用POCT应用中的强大潜力。
材料
合成寡核苷酸（表S1）和无核酸酶的水从Integrated DNA Technologies Inc.（美国爱荷华州Coralville）购买。10× rCutSmart?缓冲液从New England Biolabs（美国马萨诸塞州Ipswich）购买。D-葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸一钾盐（PEP）、兔肌肉来源的肌激酶（MK）、丙酮酸激酶（PK）、Saccharomyces cerevisiae来源的己糖激酶（HK）和人血清从Sigma-Aldrich（美国密苏里州St. Louis）购买。耐热FEN1
具有内源性内部对照（IC）的双位点PGM读数平台
该平台通过FEN1介导的flap连接处的切割，将目标特异性探针杂交转化为葡萄糖消耗信号，如图1所示。当上游探针（UP）和下游探针（DP）与目标链的相邻区域杂交时，它们形成一个包含单个核腺苷（rA）残基的切割活性flap连接，这是FEN1识别所必需的。FEN1切割释放腺苷一磷酸（AMP）（Cheng等人，2021；Wang等人，2022；Zhang等人
结论
在这项研究中，我们开发了一种包含内源性内部对照的双位点PGM读数平台，以减少即时检测EGFR外显子19缺失（19del）时信号缺失核酸检测的歧义。FEN1触发的AMP释放启动了消耗葡萄糖的酶促级联反应，使得可以使用商用PGM进行定量读数。通过结合保守的控制位点和突变识别位点，该平台改进了检测方法
CRediT作者贡献声明
Jun Ki Ahn：写作——审阅与编辑，写作——初稿，监督，资源获取。Hyo Won Jeon：写作——审阅与编辑，写作——初稿，可视化，验证，方法学，调查，正式分析，概念化。Jieun Yang：验证。Hyogu Han：方法学，概念化
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争财务利益或个人关系。
致谢
这项工作得到了韩国贸易、工业和能源部（MOTIE）资助的技术创新计划（RS-2024-00400234，开发用于超灵敏和快速多重诊断呼吸道感染的完全集成电化学微流控系统）的支持。这项工作还得到了技术创新计划（RS-2024-00403637，开发用于生物制药质量评估的分析试剂盒和自动化分析系统）的支持
