基于计算机模拟（In silico）的方法评估DsiRNA介导的冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）中精氨酸酶（Arginase）的靶向作用，作为一种新型的媒介控制策略

《Computational Biology and Chemistry》：In silico Evaluation of DsiRNA-Mediated Targeting of Arginase in Anopheles gambiae as a Novel Vector Control Strategy

本研究设计并评估了靶向冈比亚按蚊赖氨酸酶基因的DsiRNA分子，通过计算和分子动力学模拟验证其稳定性和有效性，DsiRNA6效果最佳，支持RNAi作为替代抗疟疾策略。

　　

Nina G. Yensii|Mercy Bella-Omunagbe|Titilope M. Dokunmu|Christophe Antonio-Nkondjio|Abiodun H. Adebayo|Olubanke O. Ogunlana

尼日利亚奥贡州奥塔市Covenant大学科学与技术学院生物化学系

摘要

作为疟疾主要传播媒介的按蚊对杀虫剂的抗性迅速增加，这凸显了控制这些媒介的新方法的必要性。RNA干扰（RNAi）提供了一种有针对性且对环境更友好的替代方案。按蚊中的精氨酸酶参与氮代谢，由于其在调节蚊子免疫反应和影响寄生虫发育及媒介传播能力方面的潜在作用，成为了一个极具吸引力的靶点。本研究旨在设计和评估针对按蚊精氨酸酶的Dicer底物小干扰RNA（DsiRNA）分子，以干扰寄生虫发育并减少疟疾传播。DsiRNA分子通过Integrated DNA Technologies技术设计，并根据GC含量、二级结构预测、热力学参数及脱靶效应进行了优化。所得到的21个核苷酸长的引导链通过分子对接进一步评估其与按蚊Ago2蛋白的相互作用。为了验证对接复合物的稳定性，进行了100纳秒的分子动力学（MD）模拟，结果显示稳定的RMSD轨迹、持续的氢键形成以及最小的残基波动，表明在生理条件下Ago2与引导链之间的相互作用是持久的。其中8种DsiRNA表现出最佳的生物物理特性和特异性，其中DsiRNA6、DsiRNA8和DsiRNA1具有优异的结合能和动态稳定性。这些发现表明所选DsiRNA在按蚊中敲低精氨酸酶方面的结构可行性和功能潜力，支持基于RNAi的策略作为有效的媒介控制方法。

引言

疟疾是一种持续的公共卫生挑战，影响着全球数百万人（WHO，2023年）。其主要传播媒介按蚊（Anopheles gambiae）是减少人类感染和防止寄生虫传播的关键目标。传统的控制方法包括使用杀虫剂处理过的蚊帐（ITNs）和室内滞留喷洒（IRS）（Kaindoa等人，2021年）。这些干预措施使疟疾病例在2000年至2015年间减少了68%（Bhatt等人，2015年），凸显了媒介控制在该疾病防治中的关键作用。然而，2015年至2019年间疟疾发病率仅下降了不到2%，表明进展速度明显放缓（WHO，2020年）。先前的研究将这一现象归因于杀虫剂的广泛和长期使用，导致蚊子对杀虫剂产生了广泛的抗性（van den Berg等人，2021年）。此外，还可能与疟疾媒介的叮咬和休息行为改变、人们不愿使用杀虫剂处理过的蚊帐（Antonio-Nkondjio等人，2019年；Bamou等人，2018年）、高效传播疟原虫（Plasmodium falciparum）的蚊子媒介（如按蚊）的存在（Zanga等人，2024年）以及某些地区的媒介系统多样性（Antonio-Nkondjio等人，2019年）有关。另一种补充的媒介控制策略是幼虫源管理（LSM），通过使用苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis israelensis，Bti）等制剂来减少成年蚊子数量和进入房屋的蚊子数量，从而降低传播率（Antonio-Nkondjio等人，2018年，2021年）。同时，也有针对蚊子的潜在抑制剂的研究（Adedeji等人，2025年；Chinedu等人，2024年；Ogunnupebi等人，2024年）。然而，这些方法的实施受到资金、人工劳动、需要定期重新处理或评估、社区参与度以及特定生态适应性等因素的限制，这些都影响了这些干预措施的可持续性。因此，需要新的媒介控制策略来补充现有的工具。

作为传统化学杀虫剂的替代方案，RNA干扰（RNAi）已成为一种强大且具有针对性的基因沉默工具，具有开发下一代杀虫剂的巨大潜力（Sharath Chandra等人，2019年）。RNAi利用内切酶Dicer将长双链RNA（dsRNA）切割成小干扰RNA（siRNA），通过基因沉默机制破坏mRNA，从而靶向蚊子生存、发育或繁殖所必需的基因（Adedeji等人，2024年；Mysore等人，2017年）。定制的21个核苷酸长的siRNA已被用于诱导蚊子必需基因的沉默，并显示出有效性。尽管传统的21个核苷酸长的siRNA也能发挥作用，但长度为27个核苷酸的DsiRNA由于能被Dicer酶更有效地处理，能够更牢固地结合到RNA诱导的沉默复合物（RISC）中（Rose等人，2006年），因此表现出更强的效力。

任何基于RNAi的杀虫剂的成功都依赖于目标基因的选择。大多数研究针对的是如几丁质合成酶、dop1、semaphorin-1a、延长因子1等基因（Adedeji等人，2024年；Hapairai等人，2020年；Mysore等人，2013年；Zhang等人，2010年），通过引入dsRNA/siRNA诱导蚊子的显著死亡率、发育停滞或繁殖能力下降。这些RNAi触发因子可以通过微注射、糖喂食、基于壳聚糖的纳米颗粒或酵母制剂等方式递送（Mysore等人，2023年；Zhang等人，2010年）。这些递送方式提高了dsRNA的系统分布，并保护其免受核酸酶的降解。与传统杀虫剂（如拟除虫菊酯和有机磷化合物）相比，基于RNAi的策略具有更精确的靶向性、较低的脱靶毒性和较低的耐药性发展概率，因为它们通过基因特异性沉默机制发挥作用。尽管这些传统杀虫剂制造简单且成本低廉，但其广泛使用导致了杀虫剂抗性的产生以及脱靶效应和环境污染。RNAi针对特定基因，减少了脱靶效应和环境毒性。

按蚊中的精氨酸酶（ARG）基因是一个非常有潜力的靶点（Adedeji等人，2024年）。精氨酸酶是一种重要的金属酶，能够将L-精氨酸水解为L-鸟氨酸和尿素（Li等人，2022年）。由于精氨酸酶参与多种对蚊子生存和繁殖至关重要的生物过程，它已成为此类干预措施的主要靶点（Adedeji等人，2024年）。L-鸟氨酸是多胺生产的原料，多胺对细胞增殖至关重要，特别是在卵子发生过程中（Gogoi等人，2016年）。此外，精氨酸酶还调节一氧化氮（NO）的产生，这对蚊子的免疫反应很重要。通过代谢L-精氨酸，精氨酸酶与一氧化氮合酶（NOS）在底物竞争上存在竞争，从而有效调节蚊体内的NO水平（Durante等人，2007年）。一氧化氮具有抗疟原虫的特性，使精氨酸酶成为一种双重功能的酶，影响蚊子的繁殖和媒介传播能力。因此，沉默精氨酸酶基因有望通过同时破坏其繁殖能力和免疫能力以及减少寄生虫负荷来显著降低蚊子的适应性。然而，目前尚无已知的DsiRNA能够实现高效的沉默效果。

筛选大量潜在的DsiRNA以确定哪种具有高效的沉默效果可能非常昂贵。然而，如分子对接等方法可以更快、更经济地筛选出最佳效果的DsiRNA。这种方法依赖于蛋白质三维（3D）结构的可用性（Salmaso & Moro，2018年）。在RNAi途径中，RISC的催化核心是Argonaute 2（Ago2）蛋白。遗憾的是，目前还没有任何蚊子物种的Ago2蛋白的实验确定的三维结构。本研究旨在通过计算方法评估DsiRNA对按蚊精氨酸酶基因的沉默效果。在缺乏实验确定的按蚊Ago2结构的情况下，利用Robetta服务器基于同源性建模，从候选DsiRNA中预测引导链，并将其对接到验证过的Ago2模型中，以评估RNA诱导的沉默复合物（RISC）形成的结构可行性和靶点特异性。

材料与方法

研究设计和使用的方法如图1所示。

设计靶向特异性DsiRNA分子

IDT工具预测了几种针对精氨酸酶基因的DsiRNA，其中8种遵循Ui-Tei、Amarzguioui和Reynolds的算法（表1）。

使用BLAST和GC含量进行脱靶排除

对预测的DsiRNA进行NCBI-BLASTn搜索，与整个人类基因组和转录组进行比对后，仅发现部分匹配，没有显著的脱靶相似性。这证实了我们预测的DsiRNA具有靶向特异性。这些DsiRNA的GC含量范围为37%至51.9%（表2），在理想范围内。

讨论

疟疾仍然是全球主要的健康负担，每年导致约2.63亿例病例和59.7万人死亡（WHO，2023年）。抗疟药物的耐药性持续蔓延，加上蚊子媒介对杀虫剂的抗性不断增加，严重削弱了疟疾的控制和消除策略（Minwuyelet等人，2025年；Theodoridis和Carvalho，2025年）。因此，为了应对这一趋势，人们正在探索替代的媒介控制方法。

研究的局限性

尽管本研究结合了分子对接和分子动力学模拟来评估Ago2-引导链复合物的稳定性，但它主要基于计算，缺乏实验验证，无法完全模拟按蚊体内的细胞环境复杂性，包括RNA处理动态。预测的21个核苷酸长的引导链siRNA是通过计算从27个核苷酸长的DsiRNA前体衍生而来的，以近似模拟Dicer处理后的结果；然而，实际的Dicer处理机制

结论

综合热力学、结构和对接分析以及分子动力学结果表明，DsiRNA6是最有前景的候选分子，其次是DsiRNA8和DsiRNA1，它们是针对按蚊精氨酸酶基因的有效候选分子。这些分子在特异性、稳定性和与Argonaute蛋白的结合亲和力方面表现出平衡的特性，这些都是有效RNAi介导的基因沉默的关键参数。

这些发现为验证DsiRNA的有效性奠定了基础，并为进一步研究提供了框架。

未引用的参考文献

(A, B., F, T., S, H., E, I., & O, W., 2010; van den Berg等人, 2021)

CRediT作者贡献声明

Olubanke O. Ogunlana：撰写 – 审稿与编辑，监督。Nina Ghislaine Yensii：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，可视化，方法学，数据管理，概念构思。Mercy Bella-Omunagbe：撰写 – 初稿撰写，方法学，数据管理。Titilope M. Dokunmu：撰写 – 审稿与编辑，监督。Christophe Antonio-Nkondjio：撰写 – 审稿与编辑，监督。Abiodun H. Adebayo：撰写 – 审稿与编辑，监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢Covenant大学研究、创新与发展中心（CUCRID）为本文支付文章处理费用的支持。我们还要感谢Covenant应用信息学与通信-非洲卓越中心（CApIC-ACE）的支持，以及Chi Tchampo Fru在分子动力学模拟方面的贡献。