《Analytical Chemistry》：Rapid Analysis of NAD and Other Phosphorylated Metabolites in Complex Biological Samples by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry
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为解决复杂生物样本中极性代谢物（如NAD+、NADH、ATP等）分析时间长、基质干扰大的挑战，研究人员开发了优化的HILIC-MS/MS方法，实现了磷酸化代谢物的快速、高灵敏分离与定量，显著提升了代谢组学研究的分析通量与准确性，为代谢通路与疾病标志物研究提供了有力工具。
在生命活动的微观世界里，代谢物就像细胞工厂中忙碌运转的工人和零件，它们的种类、数量和动态变化直接反映了细胞的健康状况和功能状态。其中，有一类名为磷酸化代谢物的分子，包括我们熟知的ATP（细胞的“能量货币”）、以及NAD+、NADH等关键辅酶，扮演着能量供应、信号转导和生物合成调控的核心角色。对它们进行精准、快速的定量分析，是代谢组学、乃至整个生命科学和医学研究领域的迫切需求。然而，这些分子“工人”大多具有极强的极性，在传统的色谱分析方法中难以有效分离，而且生物样本成分复杂，存在大量的干扰物质（即基质效应），使得高灵敏、高通量的精准分析成为一大挑战。现有的分析方法要么耗时过长（一次分析需要15-30分钟），要么难以在高速分析的同时保证足够的分离选择性。为了打破这一瓶颈，一篇发表在《Analytical Chemistry》上的研究，开发了一套优化的亲水相互作用液相色谱串联质谱（HILIC-MS/MS）分析方法，成功实现了对多种磷酸化代谢物的快速、精准分析。
为达成研究目标，研究人员主要运用了以下关键技术方法：1. HILIC色谱方法优化：系统测试了多种HILIC固定相（如iHILIC-(P) Classic, iHILIC-Fusion等）和不同pH值的流动相，以优化磷酸化代谢物的分离效果。2. 串联质谱（MS/MS）检测：采用动态多反应监测（dMRM）模式，对目标代谢物进行高灵敏、高选择性的检测与定量。3. 方法学验证：对所建立的HILIC-MS/MS方法在灵敏度、线性、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面进行了全面验证。4. 复杂的生物样本处理：研究使用了包括小鼠肝脏、骨骼肌、白色脂肪组织、人血浆以及大肠杆菌（E. coli）提取物在内的多种样本，并采用酸性甲醇提取后进行中和的通用前处理流程。5. 样品前处理技术评估：评估了液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE，包括C18-SPE和HILIC-SPE）等方法在降低人血浆样本基质效应方面的效果。
研究结果
优化NAD代谢物的LC-MS方法
研究人员首先优化了用于NAD+、NADH、NADP+、NADPH这四种关键辅酶分离的HILIC-MS/MS方法。通过比较不同色谱柱，发现iHILIC-Fusion固定相能够实现这四种代谢物的基线分离。进一步将色谱柱缩短至3 cm，并将流动相梯度优化后，成功将分析时间从15分钟缩短至4分钟，同时保持了足够的色谱分辨率。如图1所示，该方法能够清晰分离标准品混合物和小鼠肝脏提取物中的四种NAD代谢物。
+, NADPH, and NADP+and (B) a 10-fold diluted murine liver extract with 80% aqueous acetonitrile. Both analyses conducted on iHILIC-Fusion, SS, 30 × 2.1, 1.8 μm. Chromatogram B zoomed for better perceptibility of small peaks.">
优化用于核苷酸定量的HILIC LC-MS方法
针对更广泛的核苷酸及其衍生物（共42种分析物），研究团队进行了方法开发。初始在15 cm长柱上建立了27分钟的分析方法。通过使用更短的色谱柱（5 cm和3 cm）并优化梯度，成功建立了两种高通量方法：一种在5 cm柱上运行15分钟，另一种在3 cm柱上仅需6分钟。其中，6分钟方法虽然分析速度提升了5倍，但仍能对所有42种分析物实现可接受的峰分离度。如图2所示，两种方法均能有效分离复杂的标准品混合物。
NAD代谢物定量方法验证
对NAD代谢物的定量方法进行了全面验证。结果显示，该方法对NADH和NAD+的定量限（LOQ）低至1 nM，对NADPH的LOQ为25 nM。在肝脏提取物中的加标回收率准确度在100 ± 15%的范围内，精密度和重复性的相对标准偏差（RSD）不超过5%。此外，研究还评估了NAD代谢物在不同pH溶剂中的化学稳定性，发现氧化形式（NAD+, NADP+）在酸性条件下稳定，而还原形式（NADH, NADPH）在强酸中降解迅速，但在0.1 M甲酸中2小时内相对稳定，强调了样本提取后快速中和的重要性。
核苷酸定量方法验证
对于更广泛的核苷酸，两种方法（15分钟和6分钟）对大多数分析物的LOQ在5-30 nM之间。在人血浆中的加标回收率实验显示，大多数核苷酸的回收率超过80%，但GTP、8-oxo-dGTP、CoA等少数代谢物由于与血浆蛋白的相互作用，回收率较低（约8%或50%）。两种方法的精密度和重复性良好，且未观察到明显的残留效应。尽管在人血浆中观察到强烈的基质效应，但通过使用同位素标记的内标，仍能实现生物样本中相关代谢物的准确定量。
NAD代谢物在小鼠肝脏、骨骼肌和白色脂肪组织中的定量
使用优化的方法（0.1 M甲酸/80%甲醇提取，中和后分析）并结合同位素内标（NAD-D4, NADH-D4），成功对小鼠肝脏、骨骼肌和白色脂肪组织中的NAD代谢物进行了绝对定量。所得浓度值与已发表文献中使用可比方法获得的结果一致，验证了该方法的可靠性。
核苷酸在小鼠肝脏、骨骼肌、脂肪组织、细菌提取物和人血浆中的定量
应用所建立的HILIC-MS/MS方法，成功在多种生物样本中定量了多种核苷酸及其衍生物。如图3所示，不同组织样本呈现出独特的代谢物浓度模式，反映了它们不同的代谢功能：肝脏中ATP、ADP、AMP水平很高，凸显其能量代谢中心角色；肌肉组织中肌酸、ATP、ADP、AMP、磷酸肌酸（P-creatine）、GDP和GTP浓度较高；脂肪组织中代谢物浓度较低，以肌酸、AMP、ADP和ATP为主；血浆中代谢物水平普遍较低。在细菌（E. coli）中，共定量了28种磷酸化代谢物，包括在莫匹罗星（mupirocin）诱导的“严谨反应”中大量产生的警报核苷酸ppGpp和pppGpp。如图4所示，处理后的细菌样品中，IMP和AICAR（嘌呤合成的中间体）浓度下降，而ppGpp、pppGpp等浓度显著上升，反映了细菌代谢的快速重编程。
n = 5) and bacteria (E. coli) extracts (untreated, n= 3, μM per total cell volume). Concentrations of ppGpp and pppGpp from 2 min treatment are included for column comparison. The samples were analyzed by an optimized LC-MS method using iHILIC-(P) Classic, PEEK, 50 × 2.1 mm, 5 μm column and 15 min gradient and compared to a method on an iHILIC-(P) Classic, PEEK, 30 × 2.1 mm, 5 μm column and 6 min gradient.">
13C标记实验
作为概念验证，研究将所建立的方法应用于13C6-葡萄糖标记的小鼠多能干细胞实验。高分辨质谱和更灵敏的三重四极杆质谱分析均成功检测到了NAD代谢物及其他核苷酸中的13C标记，证明该方法可用于追踪磷酸化代谢物的标记情况，适用于代谢通量研究。
核苷三磷酸的稳定性测试
对ATP、GTP、CTP、UTP等核苷三磷酸在多种溶剂中和经历多次冻融循环后的稳定性进行了测试。结果表明，在50%甲醇、50%乙腈或水中，于-20°C储存并经历多达14次冻融循环后，均未观察到这些化合物的显著降解，为标准品的稳定储存和使用提供了依据。
HILIC-LC-MS/MS中的基质效应及样品前处理
研究发现，在血浆或组织提取物等复杂生物样本中，脂质等基质干扰会导致显著的离子抑制或增强效应。为降低基质效应，研究评估了液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE，包括C18-SPE和HILIC-SPE）两种前处理方法。LLE（使用乙酸乙酯/水体系）能实现约50%的脂质去除，且核苷酸损失仅约2%。C18-SPE能去除部分脂质，但多数核苷酸回收率仅略高于60%。HILIC-SPE虽然在去除基质方面非常有效（特别是对dUMP、IMP、CMP等早期洗脱的核苷酸有信号增强作用），但对核苷三磷酸的回收率较低。总体而言，LLE在回收率和基质去除之间取得了较好的平衡。
结论与讨论
本研究成功开发并优化了一系列基于HILIC-MS/MS的分析方法，用于复杂生物样本中磷酸化代谢物的快速、高灵敏度定量分析。核心成果包括：1. 建立了一个能在6分钟内分析42种核苷酸及其衍生物的通用HILIC方法，以及一个能在4分钟内基线分离并定量四种关键NAD代谢物（NAD+、NADH、NADP+、NADPH）的专用方法，相比传统方法（15-30分钟）大幅提升了分析通量。2. 所有方法均经过严格验证，对大多数目标物的定量限达到纳摩尔（nM）级别，并展现出良好的准确度、精密度和稳定性。3. 成功将这些方法应用于多种实际生物样本（小鼠组织、人血浆、细菌），获得了与生物学功能相符的代谢物谱图，并揭示了细菌在应激下（如严谨反应）的核苷酸动态变化。4. 证明该方法适用于13C标记实验，具备进行代谢通量研究的潜力。5. 系统评估了LLE和SPE等样品前处理技术对降低基质效应的效果，为处理极端复杂的样本提供了实用参考。
这项研究的重要意义在于，它提供了一套高效、可靠的标准化分析方案，解决了磷酸化代谢物分析中长期存在的速度与分离度难以兼顾的难题。这些优化的HILIC-MS/MS方法显著增强了代谢组学，特别是能量代谢、氧化还原平衡和细胞信号转导相关研究领域的分析能力，为深入探索代谢通路、发现疾病生物标志物以及监测微生物的应激响应提供了强大的技术支撑。
