番茄体内基因组编辑新策略：瞬时表达系统结合分生组织诱导实现无稳定转染与组织培养的突变体创制

《Frontiers in Genome Editing》：Development of in planta genome editing by transient expression of genome-editing tools in tomato

为了解决植物基因组编辑中稳定转染与组织培养依赖性强、效率低且耗时长的难题，研究人员通过农杆菌介导的瞬时表达系统（Tsukuba system），在番茄茎切面瞬时表达Cas9、gRNA及发育调控因子ipt，成功获得嵌合突变体，编辑效率达11.7%，为难以转化和再生的作物提供了快速、无需外源基因整合的编辑新途径。

　　

传统的植物基因组编辑技术通常依赖于两个核心步骤：一是通过农杆菌（Agrobacterium）介导的稳定转染，将编码Cas9核酸酶和向导RNA（gRNA）的载体整合到植物基因组中；二是通过组织培养，从已编辑的细胞中再生出完整植株。然而，这一经典路径面临双重挑战。一方面，稳定转染可能导致外源基因长期留存，增加脱靶风险并使植株被归类为转基因生物（GMO），受到严格监管。另一方面，组织培养的效率因植物物种而异，在许多重要作物中再生率极低，且整个过程往往耗时数月甚至更久。为了突破这些瓶颈，科学家们开始探索无需稳定转染或无需组织培养的“体内”（in planta）编辑方法，但此前多数方案仍依赖预先构建的Cas9转基因植株，未能完全摆脱对遗传改造的依赖。

在此背景下，一项发表于《Frontiers in Genome Editing》的研究提出了一种创新的解决方案。该研究旨在开发一种全新的、既不需要稳定转染（即外源基因不整合到基因组），也无需组织培养的基因组编辑协议。研究人员巧妙地将高效瞬时表达系统与体内分生组织诱导技术相结合，直接在番茄植株的茎切面进行操作，成功在T₀代获得了基因组编辑的嵌合突变体，为作物育种提供了一种更快速、更便捷且可能规避GMO监管的编辑工具。

研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：1. 利用高效的“Tsukuba”瞬时表达系统，该系统基于菜豆黄色矮化病毒（BeYDV）的复制子，能在植物细胞核内大量复制，实现Cas9、gRNA的高水平瞬时表达。2. 选用发育调控因子（DR）——异戊烯基转移酶（ipt）基因，通过其瞬时表达在番茄茎伤口处诱导细胞脱分化和分生组织形成，从而产生新芽。3. 通过农杆菌浸润法，将含有上述元件的混合菌液直接注射到番茄茎的切面进行感染。4. 对感染后的植株进行优化处理，包括添加液体肥料和实施短暂的37°C热激，以提升编辑效率和突变体获得率。本研究所用番茄材料为栽培种“Sicilian Rouge”。

研究结果

3.1 农杆菌浓度对番茄基因组编辑效率的影响

研究人员测试了不同浓度（OD₆₀₀= 0.8, 1.0, 1.2, 1.6）的农杆菌（携带基因组编辑工具）对编辑效率的影响。结果表明，当OD₆₀₀为1.2时，获得的突变体比例最高，在22个新生芽中鉴定出6个突变体，效率达27.3%。浓度过高（OD₆₀₀=1.6）时，虽然仍能获得突变体，但效率下降至17.6%，且感染部位容易出现组织坏死。这表明找到最适感染浓度对于平衡编辑效率和植物存活至关重要。

3.2 感染后处理对番茄基因组编辑效率的影响

为了进一步提升效率，研究团队在农杆菌感染后，对植株施加了补充液体肥料和每日3小时、连续4天的37°C热激处理。与未处理的对照组相比，这种感染后处理不仅增加了新生芽的数量，还将突变体获得率从10.1%提高到了14.5%。更重要的是，处理组中获得了更多的插入/缺失（indel）突变，而对照组仅检测到单碱基替换。在三次独立的重复实验中，采用优化后条件（OD₆₀₀=1.2 + 感染后处理）获得的平均编辑效率为11.7%。

3.3 通过瞬时表达获得的T₀代突变体芽未整合外源基因

通过聚合酶链式反应（PCR）检测，在获得的含有indel突变的突变体芽中，均未检测到用于瞬时表达的载体（pTKizCLS-SlGAD3 和 pTKB3-ipt）的整合信号。这证实了该方法确实实现了外源基因的瞬时表达而非稳定整合，有望产生无转基因成分的编辑后代。

3.4 瞬时和体内基因组编辑的突变模式多样

对突变体进行更深入的测序分析（每个株系分析20个克隆）发现，突变类型以单碱基替换为主，但也存在少量缺失和插入突变。不同突变在同一芽中以嵌合形式存在，单个突变类型的嵌合率在5%到25%之间。这表明由该方法产生的T₀代植株是包含多种编辑类型细胞的嵌合体。

研究结论与意义

本研究成功开发了一种结合高效瞬时表达与体内分生组织诱导的植物基因组编辑新策略。该方法通过在番茄茎切面瞬时表达玉米密码子优化的内含子化Cas9（izCas9）、靶向SlGAD3基因的gRNA以及发育调控因子ipt，实现了无需稳定转染和组织培养，直接在T₀代获得编辑突变体。优化后的编辑效率可达11.7%，且大部分突变体不含外源基因整合。

这项研究的重要意义在于：首先，它提供了一种潜在规避GMO监管的编辑途径，因为外源DNA仅为瞬时存在。其次，它绕过了组织培养的瓶颈，为那些难以再生的作物提供了编辑可能。第三，整个流程从感染到获得可分析的芽仅需数周，相比传统方法需要数月，大大缩短了周期。尽管目前产生的突变体多为嵌合体且以单碱基替换为主，但该研究为植物基因组编辑，特别是对转化和再生困难的物种，开辟了一条全新的、更快速、更灵活的技术路径。未来，通过优化向导RNA（gRNA）设计、开发更高效的发育调控因子组合以及精确控制蛋白表达窗口期，有望进一步提升编辑效率和获得纯合突变体的比例。