Vrn-A1a启动子与内含子1突变联合对小麦开花无叠加效应：揭示春性等位基因冷响应的复杂性

《Molecular Breeding》：Combining promoter and induced intron 1 mutations of Vrn-A1a does not accelerate flowering in wheat

研究人员为探究春性小麦Vrn-A1a等位基因中残留的低温响应性调控机制，利用CRISPR/Cas9技术构建了启动子突变与内含子1关键区域缺失（Vrn-A1aΔ901）的组合突变体。研究表明，在春小麦Cadenza背景下，联合突变并未进一步影响Vrn-A1a的表达水平或开花时间，其部分低温响应性由被删除片段之外的顺式调控元件控制。这深化了对VRN1转录调控的理解，并凸显了小麦春化调控网络的复杂性。

　　

在温带谷物中，春化（vernalization）是植物响应低温、从营养生长过渡到生殖生长的重要过程。这一开关的核心控制基因是VERNALIZATION 1 (VRN1)。冬性小麦品种携带隐性的vrn1等位基因，需要经过低温诱导才能转录激活，进而开花。而春性品种则携带显性的VRN1等位基因，能够不依赖低温而表达，从而实现早花。这种差异通常是由VRN1基因启动子（promoter）或第一内含子（intron 1）“关键区域”（critical region）的顺式调控元件（cis-regulatory element）突变引起的。一个广泛分布的春性面包小麦等位基因Vrn-A1a携带启动子突变，但其第一内含子却保留了冬性等位基因的特征。有趣的是，Vrn-A1a对低温仍表现出部分响应，这暗示了在已知的启动子突变之外，可能还存在其他调控元件。这一未解之谜，正是本研究想要探索的起点：如果我们在已经拥有启动子突变的Vrn-A1a背景下，再额外删除其内含子1中的关键调控区域，是否会“强上加强”，让开花更早、对低温更不敏感？还是说，两种突变的效应并非简单叠加？

本研究发表于《Molecular Breeding》期刊。研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在春小麦品种Cadenza（携带Vrn-A1a等位基因）中，精准删除了Vrn-A1a第一内含子中一段901碱基对（bp）的片段，该片段包含一个重要的RNA免疫沉淀片段3（RIP3）区域，被认为是潜在的阻遏蛋白结合位点。由此，他们创制了一个在自然种质中尚未发现的、同时具备启动子突变和内含子1缺失的新型等位基因Vrn-A1a^Δ901。通过比较野生型Vrn-A1a和Vrn-A1a^Δ901突变体在非春化（V0）以及14天（V14）、28天（V28）春化处理后的植株，系统分析了其开花时间、茎尖分生组织发育以及Vrn-A1基因的转录水平。

Vrn-A1a^Δ901等位基因在不同春化处理下不影响开花时间

研究人员在严格控制的光照和温度条件下，对野生型和突变体植株进行了平行培养。无论是否经过春化处理，Vrn-A1a^Δ901植株在营养生长阶段均未表现出可见的表型差异。在播种后45天解剖茎尖分生组织（SAMs），发现两者的花序发育阶段完全一致。更重要的是，对抽穗期的统计显示，在任何处理条件下，Vrn-A1a^Δ901突变体的开花时间与野生型相比均无显著差异。这表明，在Vrn-A1a背景下删除内含子1的关键区域，并不能进一步加速开花。

Vrn-A1a^Δ901等位基因不改变Vrn-A1的mRNA水平

为了从分子层面解释表型，研究人员在五个不同的时间点检测了叶片中Vrn-A1的转录本水平。统计分析表明，春化处理能显著诱导Vrn-A1a的表达（V28处理下的表达量高于V0），这与前人的研究一致。然而，关键发现在于，基因型（野生型 vs. 突变体）本身对表达量没有显著影响，且基因型与处理之间不存在交互作用。在每个处理下的每个时间点进行两两比较，经过错误发现率（FDR）校正后，Vrn-A1a^Δ901与野生型的表达量均无统计学差异。因此，诱导产生的内含子1缺失并未在任何测试的生长条件下改变Vrn-A1a的基础表达水平或其对低温的响应模式。

本研究通过创制并分析Vrn-A1a启动子与内含子1关键区域的双突变体，得出了明确的结论：在春性小麦等位基因Vrn-A1a的遗传背景下，同时干扰启动子和内含子1区域，并不能进一步激活该基因的表达或改变开花时间。这意味着Vrn-A1a中残留的部分低温响应性，是由被删除的901 bp内含子片段之外的顺式调控元件所控制的。

这一发现具有重要的理论意义。它揭示了VRN1基因存在两种相对独立的激活模型：启动子/转录起始位点（TSS）模型和第一内含子模型。在Vrn-A1a中，由启动子区域的结构变异（如重复序列和“春性回折元件”SFE插入）所主导的启动子模型占统治地位，这使得内含子1中的RIP3等调控元件变得“无关紧要”。换句话说，春性生长习性可以通过启动子突变（如Vrn-A1a）或大的内含子1缺失（如Vrn-A1c/B1/D1）两种不同途径实现；然而，将这两种突变组合起来并不会产生叠加或增强效应。这可能是由于这两种调控机制并非完全独立，而是作用于同一个功能复合体中，例如此前研究提出的连接启动子与内含子1基序的、受春化调节的染色质环。启动子水平的强效调控可能缓冲了内含子1调控位点缺失的影响，或者两者突变在功能上存在上位效应。

该研究不仅增进了我们对VRN1转录调控复杂性的理解，也突出了小麦春化调控网络的精密与冗余。它表明，在分子育种中针对单一调控元件进行修饰时，需要考虑其遗传背景和与其他元件的互作关系，为实现对开花时间的精准调控提供了新的思路。