使用羧基修饰的磁性微球与LC/MS联用技术，实现对血清和脑脊液中儿茶酚胺的超灵敏及多重分析检测

《Journal of Chromatography A》：Ultrasensitive and Multi-Analyte Detection of Catecholamines in Serum and Cerebrospinal Fluid Using Carboxyl-Modified Magnetic Microspheres Coupled with LC/MS

磁固相萃取耦合液相色谱-串联质谱法实现血清和脑脊液中六类儿茶酚胺的高灵敏度同步检测，线性范围10-10,000 ng/L，检测限低至1.33 ng/L，血清与脑脊液中儿茶酚胺浓度存在显著差异，该方法为脑外伤等神经疾病诊断提供可靠工具。

　　

林 Zhao|张瑞科|何亮|秦蓉|刘志洲|赵银诺|王淼|李莉|白鹏丽

上海大学理学院化学系，中国上海200444。

摘要

儿茶酚胺（CAs）是多种疾病的关键标志物。然而，现有的方法无法检测到足够的靶标分析物并具备足够的灵敏度。本研究开发了一种新型的羧基功能化亲水疏水平衡磁珠（HLBMB-SCOOH），用于高效提取和检测人血清和脑脊液（CSF）中的儿茶酚胺。这些微球通过悬浮聚合和羧基表面功能化制备而成。作为磁固相萃取（MSPE）与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）联用的吸附剂，它们能够同时实现六种儿茶酚胺的超灵敏分析。该方法表现出优异的线性范围（10-10,000 ng/L），检测限低至1.33 ng/L。 spiked样品的回收率在88.2%-108.4%之间，相对标准偏差低于9.1%。使用该方法分析了蛛网膜下腔出血（SAH）患者的CSF和血液样本，结果显示CSF中的儿茶酚胺浓度始终高于血液中的浓度。所提出的MSPE方法简单、高效且稳健，为血清和CSF中微量儿茶酚胺的分析提供了一种可靠的方法，可用于SAH和其他神经系统疾病的治疗评估。

引言

儿茶酚胺包括肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）及其代谢物甲基去甲肾上腺素（MN）、去甲肾上腺素（NMN）和3-甲氧基酪胺（3-MT）[1,2]，在生理过程中起着重要作用，并作为多种疾病的关键生物标志物[3]。这些化合物在血液中的水平与嗜铬细胞瘤[4]、心血管疾病[5,6]和神经退行性疾病[7]等状况密切相关。虽然血液分析提供了整体视图，但脑脊液（CSF）更直接地反映了中枢神经系统的神经传递，因此其分析对于研究神经系统病理学至关重要[8,9]。同时定量这六种儿茶酚胺及其代谢物可以提供交感肾上腺和代谢活动的全面概况，但仍存在分析上的挑战。

目前有多种方法用于儿茶酚胺的检测，包括高效液相色谱电化学检测（HPLC-ECD）[10]、毛细管电泳-紫外检测（CE-UV）[11,12,13]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[14]、纸喷雾电离质谱（PS-MS）[15]。然而，这些方法存在两个主要限制：儿茶酚胺本身的化学不稳定性[16]，更重要的是，它们无法在一次实验中同时定量所有六种分析物，从而限制了其临床应用。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）因其高灵敏度和特异性而成为多分析物儿茶酚胺测定的标准方法[17,18]。它能够监测特定跃迁，减少了基质干扰，适用于复杂的生物样本[19,20]。然而，样本的复杂性要求进行有效的预处理以减轻基质效应并浓缩靶标分析物[21,22]。虽然传统的固相萃取[23,24]、液-液萃取（LLE）[25]和蛋白质沉淀[26,27]成本低廉且快速，但往往无法充分减少基质效应或确保所有儿茶酚胺的一致回收率[28]。

相比之下，磁固相萃取（MSPE）[29,30]作为一种样品预处理方法越来越受欢迎，因为它通常简单[31]、快速且高效[32]。磁性吸附剂可以通过外部磁铁轻松回收，无需离心或过滤，简化了工作流程，特别适合从复杂基质中提取微量分析物[33,34]。吸附材料在MSPE过程中起着关键作用。近年来开发了多种磁性吸附剂，如Fe₃O₄@mZrO₂[35]、Cis-diol- (MON_S-2OH)[36]和[Co(BDC)]_N[37]，以及其他新型多孔聚合物和碳基材料[38,39]。但大多数吸附剂的分析物覆盖范围不足且灵敏度较低。为了解决这些问题，李等人[1]使用羧基和仲胺功能化的磁珠组合来同时测定尿液中的儿茶酚胺及其代谢物。然而，这种方法需要两种类型的磁珠，并未针对血清或CSF进行优化。

因此，本研究的目的是开发一种简单高效的羧基功能化磁性聚合物微球，并建立一种灵敏、选择性强的MSPE-LC-MS/MS方法，用于血清和CSF中儿茶酚胺的全面测定。微球制备的详细步骤如图1所示。亲水疏水平衡磁珠（HLBMB）是通过Fe₃O₄纳米颗粒、二乙烯基苯（DVB）和N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）的悬浮聚合制备的，随后进行羧基功能化。系统优化了改性微球对儿茶酚胺的吸附性能，并对临床样本进行了方法验证。最后，将所开发的方法应用于血清和CSF样本，以评估其在神经系统疾病诊断和治疗中的高通量多分析物生物分析中的应用。

材料

所有关于化学品和试剂的信息均见支持信息。

HLBMB的合成

HLBMB的合成通过多步骤路线完成。首先，在氮气纯化环境中，将FeCl₂·4H₂O（10.8 g）和FeCl₃·6H₂O（4.0 g）溶解在100 mL超纯水中。在25°C下连续搅拌（200 rpm）并通入氮气的同时对溶液进行脱氧处理。随后，在20分钟内逐滴加入50 mL NH₃·H₂O。然后进行反应混合物

制备和表征

根据图1A所示的策略成功制备了HLBMB-SCOOH。含有引发剂的DVB单体分散成无数滴状，并在水相和滴状液体的界面处与DVB共聚，同时亲水单体NVP也与DVB共聚。聚合物包裹OA-Fe₃O₄纳米颗粒，得到初始的HLBMB。这种逐步方法有助于确保亲水单体和疏水单体之间的可控共聚。

结论

本研究通过可扩展的合成方法制备了羧基功能化磁微球，并全面表征了它们的结构和磁性质。这些微球作为吸附剂用于MSPE与LC-MS/MS联用的过程中，建立了一种灵敏且稳健的方法，用于生物流体中六种儿茶酚胺的同时测定。该方法表现出宽线性范围（10-10,000 ng/L）、低检测限（低至1.33 ng/L）以及稳定的

CRediT作者贡献声明

林 Zhao：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据管理、概念化。张瑞科：验证、资源获取、正式分析、数据管理。何亮：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、正式分析。秦蓉：可视化、研究。刘志洲：监督、项目管理、资金获取。赵银诺：监督、资源获取、数据管理。王淼：撰写——审阅与编辑、资源管理、项目

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了吉林省与中国科学院科技合作的高科技产业化专项基金（项目编号2025SYHZ0044）和中国科学院青年创新促进协会的支持（项目编号Y2023088）。本研究已获得郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准（批准编号2025-KY-0724-001），并获得了所有参与者的书面知情同意。