通过整合全球天然产物社会分子网络技术与衍生化辅助的特征离子过滤方法，对中国黄杨（Buxus sinica）中的生物碱进行了全面分析

《Journal of Chromatography A》：Comprehensive profiling of alkaloids in Buxus sinica by integrating global natural products social molecular networking with derivatization-assisted characteristic ion filtering

采用LC-MS/MS结合GNPS分子网络分析和DBD-F衍生化特征离子过滤（CIF）技术，系统鉴定出56种Buxus sinica生物碱，创历史新高。方法创新在于融合非衍生化谱库构建与衍生化增强检测，Python CIF算法实现自动化数据处理，显著提升复杂基质中生物碱的鉴定效率和覆盖度。

　　

作者：李森 | 王松 | 程中哲

单位：华中科技大学同济医学院联合医院药学系，中国湖北省武汉市430030

摘要

由于结构多样性大、异构体复杂度高以及质谱分析中的离子化效率普遍较低，《中国黄杨》（Buxus sinica）中的生物碱进行全面表征存在困难。本研究采用了一种集成化的LC–MS/MS策略，结合了未衍生提取物的全球天然产物社交网络（GNPS）分子网络技术和衍生化辅助的特征离子过滤（CIF）工作流程，实现了迄今为止对B. sinica生物碱最全面的分析。GNPS分子网络技术基于MS/MS光谱相似性，有效地实现了结构相关生物碱的去重复和可视化，促进了主要成分的网络引导注释。同时，使用4-(N, N-二甲基氨基磺酰)-7-氟-2,1,3-苯并噁唑（DBD-F）进行化学衍生化，引入了可预测的诊断碎片离子，显著提高了离子化效率和碎片化特异性。进一步开发了一种基于Python的CIF算法，用于自动化数据预处理并选择性地提取含有特征离子的光谱，大幅提升了注释效率和覆盖率。通过整合这些互补方法，共鉴定了B. sinica中的56种生物碱，其中21种通过GNPS分析得到鉴定，44种通过衍生化-CIF得到鉴定，另有9种通过两种方法均被检测到。这一覆盖范围超过了之前关于B. sinica生物碱的研究结果，突显了分子网络技术和衍生化驱动的数据过滤方法的互补优势。总体而言，本研究为复杂植物基质中的生物碱全面分析提供了一个强大且可扩展的分析平台，为天然产物研究和药物分析提供了宝贵的参考。

引言

Buxus sinica变种parvifolia M. Cheng（B. sinica）是一种属于黄杨科的多年生药用灌木，在东亚传统医学中长期以来被用于治疗心血管和脑血管疾病、肿瘤及炎症性疾病[1,2]。该植物的药理活性主要归因于其结构多样的生物碱，尤其是甾体和三萜类化合物，它们具有心脏保护、抗肿瘤、抗胆碱酯酶、抗真菌和抗菌作用[3,4]。从B. sinica中提取的环维罗布辛D（CVB-D）因其强心和抗缺血作用而在临床实践中得到广泛应用[5,6]。迄今为止，已从该属植物中分离出200多种生物碱[3]，但对B. sinica中生物碱成分的全面、高覆盖率定性分析仍较为缺乏。这主要是由于其显著的结构多样性、频繁的位置异构性以及质谱分析中的相似碎片化行为，这些因素使得传统鉴定工作流程变得复杂。

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）已成为天然产物结构鉴定的不可或缺的工具。然而，传统的生物碱鉴定方法主要依赖于MS/MS碎片模式的手动解释和数据库匹配，这两种方法既费时又费力，且常常受到参考标准可用性的限制[7]。近年来，全球天然产物社交网络（GNPS）分子网络平台作为一种强大的非靶向MS数据分析工具应运而生，能够基于MS/MS光谱相似性对结构相关的代谢物进行可视化和聚类[8][9][10]。然而，GNPS分析严重依赖于高质量的MS/MS光谱和光谱库的覆盖率，导致低丰度或离子化能力差的化合物被忽视[11,12]。

为了解决这些问题，在MS分析前进行化学衍生化可以增强离子化效率、改善色谱行为并引入可预测的碎片模式[13,14]。这些可预测的离子特征有助于在复杂基质中识别目标化合物。尽管如此，将衍生化与先进的数据处理技术相结合进行综合生物碱分析的系统研究仍然较少。此外，随着LC-MS/MS数据集规模的不断扩大，需要自动化和智能的数据处理策略来替代手动解释，以加速发现过程。

在本研究中，我们开发了一种双模式LC-MS/MS策略，结合了未衍生提取物的GNPS分子网络技术和衍生化增强型工作流程，以及针对B. sinica衍生提取物的基于Python的特征离子过滤（CIF）算法。这种双模式策略结合了两种技术的优势：GNPS技术便于结构相关生物碱的可视化、聚类和去重复；而DBD-F试剂的衍生化作用生成了可预测的诊断离子，显著提高了离子化效率、检测灵敏度和化合物选择性。基于Python的CIF算法通过自动化预处理、特征离子识别和光谱过滤，大幅提升了数据处理的效率和生物碱注释的全面性。

利用该工作流程，在B. sinica中鉴定出了56种生物碱，其中21种通过GNPS分析得到鉴定，44种通过衍生化-CIF分析得到鉴定，另有9种通过两种方法均被确认，这是迄今为止对B. sinica生物碱最全面的定性分析结果。这一双模式平台为复杂植物基质中的生物碱分析提供了强大且可扩展的解决方案，并为其他天然产物系统的药理探索和药物发现建立了方法论框架。

试剂和材料

环维罗布辛D（CVB-D，纯度≥98%）购自天津白北生物科技有限公司（中国）。4-(N, N-二甲基氨基磺酰)-7-氟-2,1,3-苯并噁唑（DBD-F，纯度≥98%）购自Sigma-Aldrich（美国New Sawamoto）。无水乙醇购自富余化学试剂有限公司（天津，中国）。盐酸和二氯甲烷购自烟台远东化学试剂有限公司（山东，中国）。K₂-EDTA由元业生物医学技术有限公司提供。

未衍生提取物的GNPS分子网络分析

为了系统地鉴定B. sinica中的生物碱，使用UHPLC-QTOF-MS/MS对未衍生的生物碱提取物进行了分析，并利用GNPS平台生成了分子网络。GNPS是一种先进的可视化和注释工具，它根据MS/MS光谱的余弦相似性对结构相关的代谢物进行聚类。该策略有助于已知化合物的去重复以及新类似物的初步注释。

DBD-F衍生化对Buxus生物碱的化学原理和分析优势

选择DBD-F作为衍生化试剂，是因为它对亲核含氮官能团具有良好的反应性，并且在质谱分析中表现优异。化学上，DBD-F会发生亲核芳香取代反应，其中氟原子被一级或二级胺取代[17]。大多数Buxus生物碱至少含有一个可接触的氨基，使得在温和碱性条件下能够高效地共价连接DBD基团。

结论

本研究建立了一个双模式LC-MS/MS分析平台，结合了GNPS分子网络技术和衍生化-CIF工作流程，用于B. sinica中生物碱的全面分析。共系统鉴定了56种生物碱，这是迄今为止对该物种最全面的化学分析结果。GNPS和衍生化-CIF的互补应用有效解决了与离子化效率、光谱复杂性相关的问题。

CRediT作者贡献声明

李森：撰写——初稿撰写、实验设计、数据分析。王松：方法学设计、实验实施。程中哲：撰写——修订与编辑、结果验证、实验监督、方法学设计、资金申请。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（81803704, 81803717）、广西师范大学药物资源化学与分子工程国家重点实验室（CMEMR2022-B15）以及淄博市环境有机污染物与人群健康监测分析重点实验室和淄博市疾病控制与预防中心的资助。