《Journal of Chromatography B》：Optimisation and validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method for cannabis and its metabolites in urine
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本研究针对尿液样本中大麻及其代谢物在检测前需经历耗时、易降解的酶解步骤等问题，建立了一套高效、灵敏的分析方法。研究人员优化了B-One酶水解和样品净化条件，实现了对Δ9-四氢大麻酚(THC)、大麻二酚(CBD)及其羟基与羧基代谢物的快速、高回收率检测。该方法在5分钟内即可完成脱葡萄糖醛酸化反应，为毒理学检测、临床研究与药物监测提供了可靠且高效的解决方案。
大麻作为一种在全球范围内被广泛使用和研究的植物，其两种最主要的成分——Δ9-四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)——因其独特的药理活性而备受关注。THC是娱乐性大麻产生精神活性的“元凶”，而CBD则在某些特定配比的医用大麻中扮演着重要角色。无论是在公共健康、法医毒理，还是在临床研究中，准确评估个体的大麻使用情况都至关重要。尿液检测是评估大麻使用最常用的手段之一。然而，THC和CBD在人体内并非“原封不动”地被排出，它们会经历一系列复杂的代谢转化，先生成羟基代谢物（如11-hydroxy-Δ9-THC, THC-OH 和 7-hydroxy-cannabidiol, CBD-OH），再进一步转化为羧酸代谢物（如11-nor-delta-9-THC-carboxylic acid, THC-COOH 和 7-carboxy-cannabidiol, CBD-COOH）。这些代谢物的“最后一步”通常是与葡萄糖醛酸结合，形成水溶性更强的葡萄糖醛酸结合物（如THC-COOH-glucuronide和CBD-OH-glucuronide），以便于经尿液排出。因此，要在尿液中测得总的大麻素含量，就必须先将这些结合物“拆开”，即进行脱葡萄糖醛酸化反应。
传统的酶解方法往往需要长达16小时、在37°C下的漫长孵育，不仅效率低下，还可能因处理时间过长导致目标物降解，影响检测准确性。新一代的重组β-葡萄糖醛酸酶（如BGTurbo）虽然缩短了时间，但仍需在较高温度（50°C）下进行，仍存在潜在的不稳定性风险。此外，针对THC代谢物的分析方法研究较多，但对CBD及其代谢物酶解方法的研究则相对有限。与此同时，在样品进入高灵敏的液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）分析前，如何高效地去除尿液中的蛋白质等杂质，同时保证目标分析物不丢失，也是一个关键挑战。现有的净化方法通常只使用溶剂沉淀蛋白质，但可能无法完全去除细小颗粒，存在堵塞昂贵色谱柱的风险。为了应对这些挑战，来自澳大利亚昆士兰大学的研究团队开展了一项研究，旨在开发并验证一套快速、高效、可靠的LC-MS/MS分析方法，用于尿液中THC、CBD及其主要代谢物的准确定量。这项研究成果发表在分析化学领域的专业期刊《Journal of Chromatography B》上。
为了达成研究目标，研究人员运用了几个核心技术与方法。首先是液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析技术，这是实现高灵敏度、高选择性多目标物定量检测的基石。其次，研究核心是对酶水解步骤的优化，系统比较了两种重组β-葡萄糖醛酸酶（B-One和BGTurbo）在不同体积、温度和时间条件下，对三种商业化标准品（CBD-, THC- 和 THC-COOH-葡萄糖醛酸结合物）以及真实尿液样本中内源性结合物的水解效率。第三是样品净化方法的优化，比较了单独使用蛋白质沉淀（采用乙腈或丙酮-乙腈混合溶剂）、单独过滤（使用再生纤维素或聚四氟乙烯针式过滤器）以及二者联用等多种方案对目标物回收率的影响。最后，研究遵循国际规范进行了全面的方法学验证，包括线性范围、检测限与定量限、准确度与精密度、基质效应、回收率以及样品稳定性等指标的评估。研究所用的真实尿液样本来源于一项大型研究的参与者，这些参与者自我报告了大麻使用情况或二手烟暴露史。
1. 样品净化优化
研究人员比较了八种不同的净化方案。结果发现，单独过滤的回收率不理想（最高仅66%）。虽然使用丙酮-乙腈混合溶剂进行蛋白质沉淀的回收率更接近100%，但当其与过滤器联用时会产生异常高的读数。综合回收率、操作简便性和对仪器保护（防止色谱柱堵塞）的考量，最终确定的最优净化方法是：向200 μL尿液样本中加入800 μL 100%乙腈进行蛋白质沉淀，离心后，将上清液通过0.2 μm再生纤维素（RC）针式过滤器。此方案在保护色谱柱的同时，对大麻素获得了可接受的回收率。
2. 水解优化
这是本研究的一个核心比较环节。使用标准品（CBD-, THC- 和 THC-COOH-葡萄糖醛酸结合物）进行测试发现，B-One酶在室温（25°C）下仅需5分钟，当使用150-200 μL时，即可实现目标物的完全水解，且回收率良好（76-93%）。而BGTurbo酶在25°C下无法完全水解，将温度提升至50°C并孵育30分钟虽可改善水解，但导致了明显的样品降解和较差的回收率。随后，在一个自我报告大量使用大麻的个体真实尿液样本中进行了验证，同样发现B-One酶能更有效地水解出THC、THC-OH和THC-COOH，并获得最佳回收率。CBD及其代谢物在该样本中未检出。在另外三个个体的尿液样本中进一步应用B-One酶，结果证实200 μL B-One能有效水解大麻素葡萄糖醛酸结合物，使THC、THC-OH和CBD-OH从结合态中释放出来并被检测到。
3. 方法验证
在线性方面，所有6种分析物（CBD, THC, CBD-OH, THC-OH, CBD-COOH, THC-COOH）在0-100 ng/mL范围内的校准曲线均线性良好，相关系数（r2）大于0.998。该方法展现了高灵敏度，其定量下限分别为：CBD和THC 0.2 ng/mL，CBD-OH和THC-OH 1 ng/mL，CBD-COOH和THC-COOH 0.5 ng/mL。准确度和精密度在日内和日间均符合生物分析方法验证的国际标准（LLOQ点±20%内，其他点±15%内）。基质效应评估显示，CBD-OH和CBD-COOH受尿液基质的影响较大（绝对基质效应为58-67%），而其他分析物受基质影响较小。稳定性研究表明，所有分析物在三种储存温度（25°C, 4°C, -20°C）下12小时内均稳定。但CBD和THC在经历三次冻融循环后会出现降解，因此建议样本在-20°C或更低温度下储存，并在解冻后12小时内完成分析。
4. 将方法应用于真实尿液样本
将最终优化的方法（200 μL尿液 + 200 μL B-One酶，25°C水解5分钟，随后用乙腈沉淀蛋白并经过RC过滤净化）应用于三个具有不同大麻暴露史个体的真实尿液样本。检测结果显示，样本中大麻素代谢物浓度范围很广。CBD和CBD-COOH未检出；THC浓度最高达10.02 ng/mL；CBD-OH浓度最高达3.84 ng/mL；THC-OH浓度最高达222.12 ng/mL；THC-COOH浓度最高达385.62 ng/mL。这些结果与个体的自我报告情况具有一定的相关性。
结论与讨论
本研究成功开发并验证了一套用于尿液中大麻及其主要代谢物分析的LC-MS/MS方法。其核心创新与重要意义在于：首先，在酶解步骤上取得了突破。这是首项直接比较B-One与BGTurbo酶用于尿液中THC、CBD及其代谢物分析的研究。结果表明，B-One酶在室温下仅需5分钟即可高效完成脱葡萄糖醛酸化反应，相较于传统方法（16小时）或需加热的BGTurbo酶（50°C, 30分钟），大幅缩短了处理时间，降低了因加热导致分析物降解的风险，提高了分析效率与稳定性。其次，优化了样品净化流程。首次将蛋白质沉淀（100%乙腈）与再生纤维素过滤联用，在保证足够回收率的同时，有效去除了可能堵塞色谱柱的微小颗粒，增强了方法的鲁棒性。最后，该方法表现出优异的分析性能。其定量限低，线性范围宽，准确度与精密度高，为痕量大麻素检测提供了可靠工具。
在讨论中，作者将本方法与既往研究进行了对比。本方法对CBD及其代谢物的定量限优于多数前人研究。在回收率方面，本方法优于使用大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶并长时间孵育的研究，这可能得益于B-One酶的快速温和反应条件。作者也指出，CBD-OH和CBD-COOH所受的基质影响比文献报道的更为显著，这在实际应用中是需要注意的。稳定性数据强化了快速分析的必要性，支持了本方法“快速处理”的优势。
总之，这项研究建立了一种集快速酶解、高效净化、灵敏检测于一体的综合性分析方法。它解决了传统大麻素尿液分析前处理过程繁琐、耗时的痛点，为毒理学检测、临床研究、药物监测以及公共健康调查提供了一个更加高效、可靠且实用的技术方案，具有重要的应用价值。
