《Journal of Electroanalytical Chemistry》：Electrochemical sensor for miRNA-34a detection: Synergistic signal amplification for robust and sensitive analysis
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基于还原氧化石墨烯（rGO）和双链特异性核酸酶（DSN）的协同信号放大策略，结合磁珠分离技术，构建了一种高灵敏电化学miRNA-34a检测传感器。该传感器实现50.0 fM-1.0 nM宽线性检测范围（检测限16.6 fM），并通过血浆样本验证了抗干扰能力。
郑彦杰|蔡一斌|王思怡|刘春燕|杨坤|陈婉荣|张慧|谭杰|陈耀斌|庄世豪|陈伟|冯峰|滕超
福建医科大学药学院，中国福建省福州市350122
摘要
本研究开发了一种电化学生物传感器，用于检测miRNA-34a。该传感器结合了还原氧化石墨烯（rGO）的电催化特性与双链特异性核酸酶（DSN）的酶活性，并采用了磁分离技术以确保强大的抗干扰能力。通过循环伏安法（CV）将rGO电沉积到玻璃碳电极上，利用其电催化活性增强电化学响应。同时，目标miRNA-34a的存在会引发DSN介导的酶促循环反应，从而实现二次信号放大。磁纳米粒子分离技术的引入有效减少了非特异性吸收和背景干扰，使得目标miRNA的准确测定成为可能。该生物传感器表现出优异的检测性能，在宽广的线性范围内（50.0 fM至1.0 nM）实现了miRNA-34a的定量检测，检测限为16.6 fM。在使用人血浆样本的加标回收实验中，传感器能够可靠地测量不同浓度的miRNA-34a，证实了其在复杂生物基质中的强大抗干扰能力。这些发现表明，所提出的生物传感器在临床诊断和实际样品分析应用中具有巨大潜力。
引言
肺癌已成为全球发病率和死亡率最高的癌症，每年导致多达180万人死亡，占所有癌症相关死亡的18.7%[1]。此外，非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的约85%[2]。最新研究表明，miRNA-34a是一种重要的肿瘤抑制因子，在NSCLC患者血液中的表达水平明显低于健康个体[3]。这些发现表明，miRNA-34a可能作为NSCLC患者的潜在预测生物标志物[4]。因此，miRNA-34a不仅具有早期诊断NSCLC的潜力，还可作为评估治疗反应和预测患者预后的体内监测指标。电化学生物传感器因其高灵敏度和快速响应而成为miRNA检测的有希望的平台，它们通过生物识别元件特异性识别目标分析物，并将其转化为可量化的电化学信号[5]。纳米材料的集成进一步提高了传感器的性能，通过改善信号转导和增强分析灵敏度[6]。在各种纳米材料中，还原氧化石墨烯（rGO）作为一种石墨烯衍生物，由于其优异的电导率、显著的电催化活性和特定表面积，成为构建电化学生物传感平台的理想材料[7][8]。rGO通过有效固定生物探针、增强电化学信号响应和稳定检测界面，显著提高了miRNA的定量分析能力[9][10]。羟基磷灰石（HAP）纳米粒子由于其较大的比表面积、易于功能化和良好的生物相容性，在分子成像、药物递送、组织工程和生物传感等领域具有广泛的应用前景[11]。研究表明，HAP纳米粒子表面富含磷酸根离子，可与钼酸盐反应生成电活性磷钼酸盐沉淀物，使其可用作生物分子的电化学信号探针。为了提高miRNA检测的特异性和灵敏度，这些生物传感器经常与信号放大策略（如基于酶的方法或级联反应）结合使用。刘等人开发了一种使用HAP纳米粒子作为信号标记物并结合酶辅助信号放大的均相电化学传感器，在血清样本中实现了低至0.27 aM的miRNA-21检测限[12]。在各种工具酶中，双链特异性核酸酶（DSN）被广泛用于传感平台。DSN特异性切割双链DNA（dsDNA）或DNA-RNA异源双链，而对单链DNA、单链RNA或双链RNA无活性，从而对碱基错配具有高灵敏度[13]。王等人开发了一种光催化剂介导的FL/PEC双模式检测平台，结合DSN酶辅助放大和目标介导的循环放大策略，分别实现了miRNA-21和miRNA-155的6.31 fM（荧光模式）和0.25 aM（光电化学模式）检测限[14]。韩等人构建了一种双循环等温放大方法，结合DSN酶驱动的DNA步行器和改进的催化发夹组装（CHA），实现了MCF-7和22RV1细胞中miR-21和miR-141的2.95 amol（绝对量）检测限[15]。肖等人开发了一种结合CRISPR/Cas12a和DSN功能化磁纳米粒子（MNPs）的电化学生物传感器，利用DSN辅助的目标循环实现了临床样本中miRNA-1246的灵敏检测，检测限低至50 aM[16]。这些发现表明，DSN辅助的目标回收策略实现了目标miRNAs的酶促回收，从而显著增强了信号放大效果，提高了低丰度miRNAs的检测灵敏度。
尽管上述策略不断更新和完善，但体内环境的复杂性仍然是miRNA检测面临的巨大挑战。磁纳米粒子（MNPs）的尺寸通常在1到100 nm之间，可以分为三类：金属纳米粒子（例如铁、钴和镍）、金属氧化物纳米粒子（包括γ-Fe?O?、Fe?O?和铁氧体）以及合金纳米粒子（如FeCo和FePt）[17]。MNPs独特的超顺磁性使其能够对外部磁场快速响应，从而有效地从复杂生物基质中分离目标分析物[18]，这非常适合体内环境的复杂性。李等人开发了一种基于功能化共价有机框架（COFs）、磁珠辅助DNA酶切割和CHA的电化学生物传感器，用于检测人血清中的miRNA-155，实现了低至1.2 fM的检测限[19]。
因此，本研究开发了一种集成的协同信号放大系统，以“电极加载-酶放大-磁珠分离”级联为核心，充分利用了DSN介导的循环放大、在rGO上的高效加载以及通过磁珠实现的目标精确识别等互补优势。此外，还引入了HAP作为信号触发基团，建立了稳定可靠的信号输出路径。这种方法解决了传统标记物的信号不稳定问题，显著提高了整体检测性能。利用电化学探针的稳定信号和环保特性，我们设计了HAP/S1/MNP探针，用于靶向miRNA的检测。通过循环伏安法（CV）制备的rGO修饰电极表现出强大的信号放大能力，而S1探针则经过HAP功能化处理。结合DSN辅助的回收放大策略，构建了一种电化学生物传感器，为miRNA-34a的高选择性和灵敏分析提供了新方法。
材料和试剂
琼脂糖和二水合钼酸钠（Na?MoO?·2H?O）购自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）。DSN购自Evrogen JSC（俄罗斯莫斯科）。聚乙烯亚胺（PEI）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、纳米HAP和戊二醛购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。羧基磁珠（0.1–0.2 μm，0.5%）购自天津君意嘉科技有限公司。MNPs的表征
使用透射电子显微镜（TEM）对MNPs的形态进行了表征。TEM观察显示，MNPs具有明确的球形结构，分散性好，粒径分布均匀，平均粒径约为180 nm（图1A）。（见图1。）
MNPs、S1/MNPs、HAP/S1/MNPs和HAP的ζ电位值分别为-21.9 mV、-35.2 mV、-19.7 mV和12.8 mV（图1B）。
结论
开发了一种电化学生物传感器，通过两种核心技术方法实现了miRNA-34a的高灵敏度和特异性检测：HAP信号标记物与DSN循环放大的深度耦合，以及rGO和磁珠分离的协同集成。前者建立了稳定、高增益的信号放大路径，后者解决了低丰度目标在“富集-放大-检测”工作流程中的效率和特异性瓶颈问题。
CRediT作者贡献声明
郑彦杰：撰写——原始稿件、可视化、数据管理、概念化。
蔡一斌：撰写——原始稿件、可视化、数据管理、概念化。
王思怡：撰写——原始稿件、可视化、数据管理、概念化。
刘春燕：撰写——原始稿件、研究、数据管理、概念化。
杨坤：撰写——原始稿件、研究、数据管理、概念化。
陈婉荣：撰写——原始稿件、研究、数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了江苏省青年基金会（BK20231009）、国家自然科学基金（NSFC82400095）、福建省自然科学基金（2025J01706、2025J01711、2025J011164）、福建医科大学高层次人才研究基金（XN240017）、江苏省优秀博士后人才资助计划（2022ZB313）以及福建省卫生健康委员会青年科学基金（2025QNA052）的支持。
