基于氮掺杂石墨烯量子点在二氧化硅纳米通道中作为共反应加速剂的C反应蛋白高效电化学发光免疫传感技术

《Journal of Electroanalytical Chemistry》：Highly efficient electrochemiluminescence immunosensing of C-reactive protein based on the nitrogen-doped graphene quantum dots confined in silica nanochannels as co-reaction accelerators

构建了一种基于定向抗体固定化和氮掺杂石墨量子点（N-GQDs）信号放大的电化学发光（ECL）免疫传感器，用于高灵敏度CRP检测。通过将SNF纳米通道薄膜作为刚性支架，物理限域N-GQDs防止聚集并增强催化活性，同时利用普鲁兰蛋白A定向固定抗CRP抗体，显著提高抗原结合效率。该传感器采用鲁米诺-溶解氧ECL体系，N-GQDs作为“共反应物加速器”显著增强发光信号，实现1pg/mL-10ng/mL宽线性范围和0.97pg/mL超低检测限，具备优异抗干扰能力，适用于复杂临床样本分析。

　　

方新豪|张鹏|严飞

中国浙江省科学技术大学化学与化学工程学院化学系，浙江省聚合物材料表面与界面科学重点实验室，杭州310018

摘要

C-反应蛋白（CRP）是诊断感染、炎症和心血管疾病的关键生物标志物。免疫传感器常用于CRP的选择性和准确检测，但随机固定在传感器表面的CRP抗体可能会影响目标CRP与免疫传感界面的结合效率，从而降低其分析性能。本文通过定向抗体固定和氮掺杂石墨烯量子点（N-GQDs）放大ECL信号的方法，构建了一种高效电化学发光（ECL）免疫传感器，用于灵敏检测CRP。该ECL免疫传感器通过将N-GQDs物理限制在二氧化硅纳米通道膜（SNF）的开放通道中，并依次对SNF的外表面进行蛋白质A（PrA）和抗CRP抗体的修饰来实现。SNF具有高孔密度和超小纳米通道（2–3 nm），可作为支架来限制N-GQDs的聚集并增加比表面积。PrA可以结合CRP抗体的Fc片段，暴露抗原结合区域（Fab），实现高效且特异性的CRP结合，从而提高CRP的检测性能。利用鲁米诺作为ECL发光团和溶解氧（O₂作为共反应物，SNF纳米通道内的合成N-GQDs可作为“共反应物加速剂”，通过催化溶解氧生成活性氧物种并氧化鲁米诺来增强ECL信号。所得ECL免疫传感器具有宽线性范围（1 pg mL^?1至10 ng mL^?1）和超低检测限（0.97 pg mL^?1，信噪比（S/N）为3）。由于具有出色的抗干扰能力和无需复杂的样品预处理，该平台在复杂临床样本中具有高度敏感的CRP检测潜力。

引言

C-反应蛋白（CRP）是由肝脏合成的一种经典急性期反应物，是全身性炎症、组织损伤和细菌感染的高度敏感生物标志物[1]、[2]。近年来，血清CRP水平升高也被认为是心血管疾病（动脉粥样硬化和急性心肌梗死）[3]、2型糖尿病的微血管并发症[4]以及COVID-19进展[5]的重要预测指标。健康人血清中的CRP浓度通常较低（1–3 μg mL^?1），但在急性炎症反应期间会急剧升高，例如在细菌感染或急性炎症时可达200 μg mL^?1，在病毒感染或轻度炎症时为10至40 μg mL^?1[6]。因此，开发快速、灵敏和准确的CRP定量分析方法对于早期临床诊断和预后监测具有重要意义。

已建立了多种CRP检测分析技术，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[7]、荧光免疫测定[8]、表面等离子共振[9]、电化学[10]和电化学发光（ECL）[11]、[12]。其中，ECL免疫测定因其接近零的背景值、宽线性范围和高灵敏度而脱颖而出。特别是鲁米诺-溶解氧（O₂）ECL系统受到广泛关注，因为O_{22系统的ECL效率常受溶解氧电化学还原动力学缓慢的限制。为了解决这一问题，通常引入纳米材料作为共反应物加速剂，以显著增强“鲁米诺-溶解氧”系统的ECL信号[14]、[15]、[16]。}

氮掺杂石墨烯量子点（N-GQDs）因其独特的量子限制效应和丰富的活性位点而成为促进活性氧物种（ROS）生成的优秀催化剂，从而放大ECL信号[17]。然而，像大多数零维纳米材料一样，N-GQDs由于高表面能和水溶性容易在电极表面聚集或溶解在溶液中，这严重降低了它们的催化活性和稳定性。为了解决聚集和泄漏问题，将纳米材料物理限制在多孔基质中已被证明是一种有效策略[18]、[19]、[20]。二氧化硅纳米通道膜（SNF）具有超小孔径（2–3 nm）、垂直排列的通道和高孔密度，广泛用于制造灵敏的抗污染传感界面，并在复杂基质中表现出优异的分析性能[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。SNF可以为纳米材料提供理想的支架，有效改善电极性能[26]、[27]、[28]、[29]。SNF的刚性框架可作为“纳米反应器”，物理限制N-GQDs在通道内，防止其聚集，同时允许小分子（如鲁米诺和溶解氧）自由扩散。这样限制在SNF通道内的N-GQDs表现出较大的比表面积和对电活性分子或溶解氧的优异催化能力，用于电化学检测小电活性分子或构建针对碳水化合物抗原199和碳水化合物抗原125的ECL免疫传感器[30]、[31]。

目前，基于抗体和抗原相互作用的免疫测定技术是临床CRP测量的主要方法[32]。对于免疫传感器，通常通过非特异性物理吸附或随机共价偶联将特定的抗CRP抗体引入传感界面，导致抗体随机取向，从而阻碍抗体的抗原结合位点（抗原结合区域（Fab）的结合。因此，固定在传感界面上的抗体的排列状态对生物识别界面的效率和免疫传感器的分析性能至关重要[33]、[34]。为了解决这个问题，定向抗体固定策略是一种有效的方法，可以提高目标抗原的捕获效率和灵敏度[35]。蛋白质A（PrA）是一种来自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，对免疫球蛋白（IgG）的Fc区域具有特异性高亲和力[36]。通过用PrA修饰传感界面，捕获抗体可以高度定向地固定，其Fab区域向外暴露于溶液中，从而显著增强免疫复合物的形成和整体分析性能。

在这项工作中，我们通过结合N-GQDs的信号放大和PrA介导的位点特异性抗体固定，构建了一种高度灵敏和选择性的CRP检测ECL免疫传感平台。SNF被用作刚性支架，将N-GQDs物理限制在其超小通道内，有效防止N-GQDs的聚集，同时保持其高催化活性。在该系统中，受限的N-GQDs作为“共反应物加速剂”，催化溶解氧的还原，从而显著增强鲁米诺-溶解氧系统的ECL发射。此外，PrA被修饰在SNF的外表面，以捕获抗CRP抗体的Fc区域，确保抗原结合位点（Fab）向外定向，以实现最大的免疫反应效率。这种协同策略不仅解决了抗体随机取向的问题，还大大提高了分析灵敏度，为复杂临床样本中CRP的精确定量提供了有希望的方法。

实验部分

试剂和材料、测量和仪器、N-GQDs和SNF/ITO的合成在补充材料部分有详细描述。

Ab/PrA/N-GQD@O-SNF/ITO免疫传感器的制备

所提出的Ab/PrA/N-GQD@O-SNF/ITO免疫传感器的构建策略和ECL传感机制如图1所示。首先，根据先前的报道[37]、[38]，使用St?ber溶液生长方法在导电氧化铟锡（ITO）基底上生长SNF。去除模板（表面活性剂胶束，SM）后，用GPTMS对SNF的外表面进行功能化，生成活性环氧基团（表示为O-SNF/ITO）。为了构建高灵敏度的

结论

总结来说，基于SNF限制的N-GQDs和定向抗体固定，成功开发了一种新型ECL免疫传感器，用于超灵敏检测CRP。SNF发挥了双重作用：作为纳米反应器限制N-GQDs，使其作为高效的共反应物加速剂来放大鲁米诺-溶解氧系统的ECL信号；同时作为PrA组装的基底，确保抗CRP抗体的最佳取向。得益于这种协同效应

CRediT作者贡献声明

方新豪：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析、数据管理。张鹏：撰写——原始草稿、验证、研究、数据分析、数据管理。严飞：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：严飞报告称获得了浙江省自然科学基金的支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国浙江省自然科学基金的支持（LMS25B050001）。