《Marine Policy》：Protocol optimization for microplastic analysis in sea turtles: Including the first blood digestion method
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海龟微塑料标准化提取方法研究首次建立涵盖血液等多组织的两步消化法，回收率达70-83.5%，为海洋生物污染提供方法学基准。
朱莉娅·德·安德拉德·利马·贝尔托蒂（Giulia de Andrade Lima Bertotti）、热拉尔多·乔治·巴尔博萨·德·莫拉（Geraldo Jorge Barbosa de Moura）、加布里埃拉·乌肖亚·索扎·德·梅德埃罗斯（Gabriela Uch?a Souza de Medeiros）、卢阿娜·罗查·德·索扎·保利诺（Luana Rocha de Souza Paulino）、西尔玛拉·罗西（Silmara Rossi）和安德烈娅·内维斯·费尔南德斯（Andreia Neves Fernandes）
南里奥格兰德州联邦大学（UFRGS）化学研究所，邮编91501-970，阿雷格里港，巴西
摘要
由于海龟寿命长、食物链多样且具有迁徙行为，它们特别容易受到微塑料的生物累积影响。然而，用于处理复杂生物样本的标准化方法仍然有限。本研究介绍了一种标准化、可重复的两步消化协议，用于从海龟组织（包括血液、卵黄囊、肝脏、肾脏、肌肉和生殖组织）中提取微塑料。样本来自两个不同的生物学背景：(i) 来自繁殖期雌性的血液及其卵中的卵黄囊，以评估潜在的母体转移；(ii) 来自巴西东北海岸搁浅个体的肝脏、肾脏、肌肉和生殖组织，以评估环境中的生物累积情况。首先在繁殖期样本中测试了消化效率，最终优化出一种两步协议：先使用10%的氢氧化钾（KOH）进行消化，然后再用30%的过氧化氢（H?O?）进行氧化。所有消化后的膜都显示出极少的有机残留物，从而可以可靠地观察微塑料颗粒。优化后的方法在血液中的回收率为83.5%，在卵黄囊中为73.1%，在肝脏中为75.4%，在肾脏中为70.9%，在肌肉中为82.0%。此外，还对从实际样本中回收的微塑料进行了初步的物理表征，以证明该协议的适用性。据我们所知，这是首次系统地将这种化学消化方法应用于多种海龟组织的研究，并验证了血液样本的处理方案。总体而言，这一方法框架为未来研究海洋爬行动物和其他脊椎动物的微塑料污染及潜在母体转移途径奠定了基础。
引言
微塑料在环境中的普遍存在促使了大量研究关注其对海洋生态系统保护的影响以及对暴露生物的负面影响（Li等人，2018；Paul等人，2024）。一个显著后果是微塑料在动物组织中的滞留和潜在生物累积（Yan等人，2025）。微塑料出现在胃肠道以外的组织中，表明它们能够穿越生物屏障，可能干扰生理过程，导致毒性效应、免疫失调以及可能的代际转移（Bilal等人，2023；Campos等人，2025；Chemello等人，2023a；Khan等人，2025；Merrill等人，2023；Nauman，2025；Wang等人，2019）。
海龟因其能够生物累积污染物而广被认为是海洋环境健康的指示物种——这与它们缓慢的新陈代谢、漫长的生命周期、多样的食物链相互作用、对沿海觅食区域的固定偏好以及跨海洋的迁徙行为有关（Duncan等人，2024；Finlayson等人，2016；Santos等人，2025；Savoca等人，2025）。此外，海龟还被认为适合用于评估持久性有机污染物（POPs）的母体转移，进一步凸显了它们作为代际污染物暴露指示物种的重要性（Mu?oz等人，2024；Vermeiren等人，2025）。
全球七种海龟物种中都发现了微塑料（Duncan等人，2019），这表明微塑料与海洋栖息地的塑料污染有广泛的相互作用。然而，大多数研究集中在胃肠道上，发现微塑料存在于食道、胃、肠道和粪便中（Aranda等人，2024；da Costa和de Freitas，2025；Kimura等人，2024；Meaza等人，2021；Park等人，2023；Rodríguez等人，2022；Schirò等人，2025），并与其引起的胃肠道紊乱、进食行为改变以及生理或微生物组紊乱相关（Biamis等人，2021；Di Renzo等人，2021；Iurk等人，2024；Nelms等人，2016；Savoca等人，2018；Yaghmour等人，2021）。
只有少数研究调查了微塑料在胃肠道以外的分布。针对肝脏、肾脏、心脏和生殖器官（Costello等人，2025）以及胚胎组织（Chemello等人，2023b；Curl等人，2024）的报告表明，微塑料可以在消化系统外的组织中积累，并提供了微塑料可能传递给后代的初步证据。尽管微塑料本身没有主动运输的能力，但其物理化学性质（如小尺寸和表面反应性）结合生理过程（如卵黄生成）可能有助于将足够数量的微塑料从雌性传递到发育中的卵细胞（Koelmans等人，2016；Mu?oz和Vermeiren，2019）。在卵生爬行动物中的实验研究表明，胚胎发育期间存在的纳米塑料可引起代谢和生理变化（He等人，2025），表明早期发育阶段可能特别容易受到塑料污染。
尽管有这些发现，但在微塑料研究中，系统性的组织分析仍不够充分。血液已被证明是评估人体内微塑料转移和暴露的有效样本（Lee等人，2024；Leonard等人，2024）。然而，其富含蛋白质和复杂的细胞结构给分析带来了困难，尤其是对于爬行动物而言，标准化的气体净化/质量控制（QA/QC）程序和高效去除有机物同时保持颗粒完整性的消化协议仍然有限（Hurley等人，2018）。最近的综述强调了各种微塑料提取方法，并指出需要统一这些方法以便于不同研究之间的比较（Di Fiore等人，2024；Roslan等人，2024；Zhao等人，2025；Zielli等人，2026），因为回收效率和颗粒完整性取决于实验条件（Capuozzo等人，2025）。
在海龟研究中，最常用的试剂是10%的氢氧化钾（KOH），尽管孵育体积、温度和时间长度存在很大差异。这种方法对中等脂肪含量的组织（如后期的卵黄囊，Chemello等人，2023b）和瘦肉组织（Costello等人，2025）有效，而富含脂质的组织可能需要额外步骤（如添加乙醇）以防止皂化（Dawson等人，2020）。然而，软组织的生化组成不均匀，脂质、蛋白质和结缔组织含量的变化会影响消化效率、膜的清洁度和颗粒回收率。
除了基于KOH的消化方法外，还实验评估了其他方法，包括芬顿试剂（Fenton's reagent）、过氧化氢（H?O?）、酶溶液和矿物酸，以评估消化效率和聚合物的抗性（López-Rosales等人，2026；Pfeiffer和Fischer，2020；Podbielski等人，2024；Rosales等人，2024；Toto等人，2023）。尽管这些研究代表了方法上的进步，并包括了一些生物样本中的回收评估，但在海洋大型动物中的验证仍然不足，特别是涉及循环组织的多组织验证。因此，开发一种能够在标准化参数下处理多种组织的统一且经过实验验证的消化协议对于确保结果的可靠性和可比性至关重要。
在此背景下，本研究介绍了一种标准化的两步消化和优化协议，用于从海龟组织（包括血液）中分离微塑料。虽然氢氧化钾（KOH）和过氧化氢（H?O?）曾被单独使用，但将它们依次应用于不同的海龟组织中，可以形成一个集成的多组织框架，从而获得干净的过滤膜和一致的微塑料回收率。本研究旨在作为方法学验证框架，而不是对微塑料负担的生物学调查，重点关注协议的性能和可重复性，而不是种群水平的污染模式。使用海龟作为模型物种可以扩展到其他海洋生物指示物种的应用，而包括血液分析则可以将研究扩展到内部组织和颗粒循环。因此，这一经过验证的协议有助于更可靠和可比地评估生物系统中的微塑料污染。
样本收集
本研究采用了两种不同的采样方法：(1) 繁殖期采样；(2) 非繁殖期采样。研究区域和所用个体的信息见文本S1和表S1。繁殖期采样是在巴西伯南布哥州伊波茹卡（Ipojuca）海岸对海龟巢穴进行持续监测期间进行的。从玳瑁（Eretmochelys imbricata）正在产卵的雌性海龟中收集了血液样本（根据CEUA编号1,412,271,123）
消化协议测试
进行了初步测试，以评估不同化学消化处理方法对海龟样本的效果。使用两种浓度的氢氧化钾处理未发育的海龟卵，得到了表面可见脂质残留物的透明溶液（表2a）。30%的氢氧化钾处理导致更多的脂肪残留物积累，这些残留物聚集形成类似板块的结构，需要手动清除后才能过滤。相比之下，10%的氢氧化钾处理...
结论与展望
本研究建立了一种快速、低成本且有效的两步消化协议，用于从海龟的各种生物样本中提取和表征微塑料。在适当的程序控制下，该方法表现出高回收率和在不同生化组成的组织中的稳定性能。尽管不同组织间的消化效率存在差异——尤其是在富含脂质的组织中——但通过优化试剂组合...
CRediT作者贡献声明
朱莉娅·德·安德拉德·利马·贝尔托蒂（Giulia de Andrade Lima Bertotti）：撰写原始稿件、可视化处理、验证、方法学设计、调查、数据分析、概念化。热拉尔多·乔治·巴尔博萨·德·莫拉（Geraldo Jorge Barbosa de Moura）：可视化处理、验证、监督、方法学设计、概念化。加布里埃拉·乌肖亚·索扎·德·梅德埃罗斯（Gabriela Uch?a Souza de Medeiros）：可视化处理、验证、方法学设计、调查、数据分析。卢阿娜·罗查·德·索扎·保利诺（Luana Rocha de Souza Paulino）：可视化处理、验证、方法学设计、调查、数据分析。西尔玛拉·罗西（Silmara Rossi）：
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT（GPT-5-mini，OpenAI）来协助语言修订并提高文本的清晰度。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢CAPES为G. A. L. Bertotti提供的博士奖学金（代码001）、乌弗雷齐帕州立大学（UFRPE）和南里奥格兰德州联邦大学（UFRGS）的研究生项目、爬行动物学和古爬行动物学研究实验室（LEHP-UFRPE）、环境过程和新兴污染物实验室（LAPACE-UFRGS）、非政府组织ECOASSOCIADOS以及环境监测中心（CEMAM-UERN）的支持与合作。A.N. Fernandes感谢...
