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为解决RNA靶向CRISPR-Cas13酶在体内的精确切割机制尚不明确的问题，研究人员开展了关于Cas13靶RNA切割位点的研究。结合体内外方法，他们揭示了Cas13b/Cas13bt亚型主要在特定位点切割，并通过理性设计提升了切割精度。基于此，团队开发了RNA片段编辑(RSE)技术，成功在细胞中修复了功能失调的RNA。该研究为RNA靶向治疗和基础研究提供了新工具。
在生命科学的工具箱里，CRISPR-Cas系统以其强大的基因编辑能力彻底改变了生物技术领域。然而，与人们熟知的DNA编辑工具Cas9不同，RNA靶向的CRISPR-Cas13系统展现出了独特的魅力与挑战。Cas13酶不仅能精准地“瞄准”并切割特定的目标RNA，从而调控基因表达，还拥有一种被称为“旁系切割”的“广谱”活性，使其在病毒检测等领域大放异彩。尽管Cas13作为RNA敲低工具已被广泛应用，但其“体内”是如何具体完成切割工作的，其“手术刀”到底落在RNA链的哪个精确位置，却依然笼罩在一团迷雾之中。这种机制层面的模糊性，严重限制了我们对其进行精准改造，从而开发出更安全、更高效的RNA编辑工具。为了拨开这层迷雾，并最终实现对RNA的精准“外科手术”，一个研究团队踏上了探索Cas13切割密码的征途。
为了回答上述问题，研究人员结合了体外和体内的实验方法。具体而言，他们利用深度测序技术解析了Cas13酶在体内和体外环境下的精确切割位点。通过构建并分析Cas13靶向的RNA文库，并辅以生物信息学分析，研究人员确定了不同Cas13亚型的切割偏好性。此外，他们还采用了基于结构信息的蛋白质理性工程（rational engineering）策略，对Cas13酶进行改造，以验证其切割位点偏好性的分子基础，并最终基于此开发了新的RNA编辑方法。
Cas13在体内和体外切割目标RNA的精确位点
通过系统的体内外实验分析，研究人员发现，Cas13对目标RNA的切割并非随机。他们揭示了一些Cas13亚型，特别是Cas13b和Cas13bt，倾向于在RNA链上特定的、占主导地位的位点进行切割。这为理解Cas13的“手术”精度提供了首个精确的“坐标图”。
通过理性工程改善Cas13的切割精度
基于对Cas13切割位点的精确了解，研究人员对Cas13蛋白进行了理性的工程化改造。他们通过定点突变等手段，设计出了切割位点更为精确、特异性更高的Cas13变体。这一结果表明，Cas13的切割精度并非固定不变，而是可以通过人为设计进行优化和提升的，为定制化Cas13工具的开发铺平了道路。
开发RNA片段编辑（RSE）以修复功能失调的RNA
将上述基础研究发现转化为实际应用，研究人员构建了一种名为RNA片段编辑（RNA Segment Editing, RSE）的新方法。RSE的核心原理是利用经过工程化改造的、具有精确切割位点的Cas13，在目标RNA的特定位置进行“定点”切割，随后利用细胞自身的RNA修复机制，将一段外源的、功能正常的RNA序列“缝合”到切口处。通过这一策略，研究团队成功地在细胞模型中，将原本功能异常的RNA修复为具有正常功能的RNA，实现了对RNA的精准“改写”和功能恢复。
综合以上研究结果，本工作系统阐明了Cas13酶，特别是Cas13b和Cas13bt亚型，在体内切割目标RNA的精确分子机制，确定了其优势切割位点。更重要的是，研究者并未止步于机制解析，他们通过理性蛋白质工程，成功提升了Cas13的切割精度，并以此为基础，创新性地开发出了RNA片段编辑（RSE）这一全新的技术平台。RSE技术展示了在细胞环境中对缺陷RNA进行定点修复和功能重塑的能力，为治疗由RNA功能异常引起的疾病（如某些遗传病、癌症等）提供了全新的潜在工具。这项研究不仅深化了我们对CRISPR-Cas13系统基础原理的理解，更架起了一座从基础认知通向实际应用的桥梁，预示着精准RNA工程时代在治疗学和基础研究领域的广阔前景。该研究成果已发表于《自然-通讯》（Nature Communications）期刊。
