《Applied Materials Today》：3D printing and chitosan complexation of ulvan/poly(vinyl alcohol) hydrogels for wound healing
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Ulvan基水凝胶的3D打印及生物相容性研究。采用Ulvan-PVA混合溶液通过湿纺3D打印技术制备具有不同纤维间距的水凝胶，经壳聚糖交联后实现2周水稳定性。拉伸模量17-25kPa，断裂伸长率>180%，细胞实验证实其生物相容性，且与MMP9、TGF-β1结合效能显著。
西蒙娜·布拉奇尼（Simona Braccini）| 桑格拉姆·凯沙里·萨马尔（Sangram Keshari Samal）| 詹尼·佩科里尼（Gianni Pecorini）| 桑托什·库马尔·贝赫拉（Santosh Kumar Behera）| 安东内拉·马纳里蒂（Antonella Manariti）| 达里奥·普皮（Dario Puppi）
比萨大学化学与工业化学系，意大利比萨INSTM – 比萨G. Moruzzi街13号，56124
摘要
- 将3D打印技术应用于从海藻中提取的多糖——乌尔万（Ulv），为制造符合可持续发展理念的定制水凝胶提供了新的策略。然而，迄今为止，这种可能性仅针对可光交联的乌尔万衍生物得到验证，而未涉及天然乌尔万本身。本研究旨在开发一种新的3D打印方法，利用天然乌尔万制备用于伤口敷料的水凝胶。为此，优化了一种将乌尔万与聚乙烯醇（PVA）（质量比50:50）在水溶液中直接混合的工艺，并将所得混合物沉积到乙醇浴中，从而实现不同纤维间轴向距离（1、2或4毫米）的水凝胶3D打印。通过聚电解质与壳聚糖（Cs）的复合实验（包括吸水性、光谱和热分析），证实这些3D打印水凝胶在水环境中可稳定存在两周。膨胀后的3D打印水凝胶具有17–25千帕的拉伸模量，符合伤口愈合应用的要求，其断裂伸长率超过180%。利用小鼠成纤维细胞系的体外实验表明，这些水凝胶具有细胞相容性，并能支持伤口愈合过程。通过计算机模拟分析了3D打印水凝胶与对伤口愈合起关键作用的蛋白质（如基质金属蛋白酶-9（MMP9）和转化生长因子β-1（TGF-β1））的结合能力。这些结果为使用未经化学改性的天然海藻多糖制备3D打印水凝胶用于伤口护理应用提供了有希望的起点。
引言
- 乌尔万（Ulv）是一种硫酸化的酸性杂多糖，存在于多种绿藻的细胞壁中。它主要由基于鼠李糖-3-硫酸酯残基的二糖单元组成，这些残基通过(1?4)糖苷键与葡萄糖醛酸或艾杜糖酸残基相连。不同因素（如藻类种类、收获季节、培养方法和提取工艺）会影响单体单元的比例以及其他残留物（如木糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖）的存在。
- 从可再生藻类生物质中提取乌尔万的环保工艺使得高附加值材料的可持续生产成为可能。乌尔万的化学多样性和生物相容性已被用于多种潜在应用，例如化妆品成分的封装[3]和热响应性蛋白质的释放[4]。特别是，越来越多的研究表明乌尔万具有多种生物活性，这促进了其作为生物医学材料的研究，包括膜、颗粒、三维（3D）水凝胶和纳米/微纤维等多种形式[5]。艾杜糖酸和硫酸基团的存在使乌尔万在结构上与哺乳动物细胞外基质（ECM）中的糖胺聚糖（GAGs，如肝素、软骨素硫酸盐和透明质酸）具有显著相似性。由于这些模拟特性，乌尔万在再生医学中作为动物来源GAGs的生物活性替代品具有巨大潜力，尤其是在伤口愈合方面。GAGs类分子有助于调节生长因子信号传导，减少氧化应激，从而帮助伤口微环境从慢性炎症状态转变为活跃的组织再生状态。此外，它们还通过促进成纤维细胞增殖、增强纤溶功能和调节细胞粘附发挥关键作用[6]。
- 鉴于乌尔万的高水溶性，人们采取了多种策略来优化其在生理条件下的应用。通过化学交联（例如通过紫外光交联乌尔万甲基丙烯酰（UlvMA）衍生物[7]），可以制备在水环境中具有高稳定性的3D水凝胶。还研究了UlvMA大分子 initiator，通过将热敏聚合物（如聚(N-异丙基丙烯酰胺）接枝到聚合物主链上来开发具有热凝胶特性的化合物[4][8]。酶促交联也成功应用于通过共价键将酪胺单元连接到乌尔万羧基上的化学改性乌尔万[9]。另一种稳定乌尔万基水凝胶的有效方法是通过与多阳离子（如壳聚糖（Cs）形成离子相互作用。在温和的酸性条件下，Cs中的D-葡糖胺残基的质子化氨基可以与乌尔万中的负电荷羧酸酯和硫酸酯基团建立强静电相互作用，形成作为水凝胶行为的聚电解质复合物（PEC）[10]。
- 3D打印（也称为增材制造）涉及计算机辅助的设计和制造3D物体的过程，通常是逐层进行。生物医学科学界对3D打印方法的兴趣在于其在材料选择、高制造精度和重复性方面的巨大优势，以及能够物理再现解剖结构的数字模型[11]。已经开发出针对多种多糖的优化工艺，以制备用于不同生物医学应用的定制水凝胶[12]。这些多糖良好的生物相容性、在水介质中的溶解性以及其功能化学基团的多样性，使得为生物医学3D打印开发定制策略成为可能。天然聚合物的化学改性是调节挤出打印溶液流变特性的有效方法，同时也便于引入适用于光交联的官能团，例如明胶甲基丙烯酰（GelMA）[13]。其他直接的交联策略也包括在二价阳离子存在下的藻酸盐离子凝胶化[14]、两种相反电荷聚离子之间的PEC形成[15]以及明胶的温度依赖性溶胶-凝胶转变[16]。
- 本研究首次探索了将3D打印技术应用于天然乌尔万水溶液的可能性。最近，Chen等人[17]描述了使用UlvMA衍生物与GelMA结合开发新型生物墨水的过程。Das等人[18]证明，乌尔万MA水溶液可以通过槽光聚合制备出具有定制形状和微观结构的3D物体，无需与GelMA混合。尽管乌尔万和其他藻类多糖因其对可持续生物经济的明显潜力而在生物医学加工中受到关注[19]，但文献中尚未报道过天然乌尔万的3D打印。因此，我们开发了适用于计算机辅助湿法纺丝（CAWS）的乌尔万水溶液配方，这是一种基于将聚合物溶液挤出到凝固浴中以实现材料固化的3D打印方法[20]。将乌尔万与聚乙烯醇（PVA）混合，PVA是一种批准用于人类临床应用并作为药品包衣材料的合成聚合物[21]，以优化所得溶液的加工性能。具有三种不同纤维间轴向距离（dxy）的3D打印水凝胶经过后处理，包括与壳聚糖（Cs）的聚电解质复合，以提高其在水环境中的稳定性。通过扫描电子显微镜（SEM）、吸水性测试和拉伸测试对开发的原型进行了表征，以选择最佳的dxy值。还进行了傅里叶变换红外（FTIR）和核磁共振（NMR）光谱分析、元素分析、热重分析（TGA）和差示扫描量热法（DSC）分析，以评估在37°C PBS培养下的成分变化。使用小鼠胚胎成纤维细胞系Balb/3T3 A31进行了细胞相容性和伤口愈合的体外实验。此外，还进行了计算机模拟分析，以评估新设计的3D打印水凝胶与参与伤口进展和愈合的蛋白质MMP9和TGF-β1的结合能力。
材料
- 乌尔万（Ulv）是从法国普卢比安地区的Ulva lactuca中提取的，方法如前所述[3]。壳聚糖（Cs）由Sigma-Aldrich（意大利米兰）提供，编号448869，批号SLBJ5775V[20]。使用的其他试剂包括聚乙烯醇（PVA，Mw = 89000–98000 g/mol，99%以上已水解）、醋酸、乙醇、二氧化氘（D2O）和三氟乙酸（CF3COOH），均来自Sigma-Aldrich（意大利米兰）。
3D打印
- 将乌尔万加入水中（浓度为5% w/v），并在室温下磁力搅拌2小时使其溶解。
3D打印、后处理和形态分析
- 所开发的制造过程包括将基于乌尔万的水溶液直接挤出到乙醇浴中，并逐层沉积所得聚合物纤维（图1A）。当仅使用纯乌尔万溶液时，所得结构缺乏从浴中取出后进行后处理而不破裂所需的稳定性。因此，研究了与PVA混合以改善加工性能的有效性。
结论
- 本研究的主要假设——涉及聚合物加工、打印后处理和生物医学应用——得到了验证。确实，开发了一种在生理介质中稳定的乌尔万-PVA-Cs水凝胶的3D打印工艺。在水溶液中混合PVA可以更好地控制材料沉积，并在从凝固浴中回收过程中保持样品的结构稳定性。此外，通过壳聚糖（Cs）的聚电解质复合进行后处理是必要的。
CRediT作者贡献声明
西蒙娜·布拉奇尼（Simona Braccini）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学、研究、概念化。
桑格拉姆·凯沙里·萨马尔（Sangram Keshari Samal）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学、研究、概念化。
詹尼·佩科里尼（Gianni Pecorini）：初稿撰写、方法学、研究。
桑托什·库马尔·贝赫拉（Santosh Kumar Behera）：初稿撰写、软件应用、方法学、研究。
安东内拉·马纳里蒂（Antonella Manariti）：初稿撰写、方法学、研究。
达里奥·普皮（Dario Puppi）：撰写 –
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
感谢比萨大学Ateneo研究项目（PRA 2020（项目编号PRA_2020_37）的财政支持。特别感谢比萨大学的Andrea Corti博士和Massimo Guelfi博士在SEC和元素分析方面提供的帮助。
