通过微波辅助加热干燥技术，利用CRISPR/Cas12a介导未修饰的金纳米粒子（AuNPs）的聚集，实现无标记检测大肠杆菌O157:H7

《Biosensors and Bioelectronics》：CRISPR/Cas12a-mediated aggregation of unmodified AuNPs via microwave-assisted heating-dry for label-free detection of Escherichia coli O157:H7

CRISPR/Cas12a结合无标记金纳米颗粒和微波辅助干燥实现快速病原体检测，灵敏度达5 CFU/mL，适用于复杂样本和资源有限场景。

　　

作者：贾敏|如新宇|冰欣|翟飞|黄曼|杜欣

山东省动物抗性生物学重点实验室，山东师范大学食品营养与安全重点实验室，山东师范大学生命科学学院，济南，250014，中国

摘要

CRISPR/Cas12a已成为开发下一代生物传感器的强大平台，但实现快速、无需仪器的可视化检测仍然是一个挑战。传统的CRISPR-AuNP检测方法依赖于预先功能化的硫醇修饰金纳米粒子（AuNPs），这种修饰会引入空间障碍，减缓Cas12a的催化效率，并增加成本和复杂性。在这里，我们开发了一种快速、无标记的颜色检测平台，该平台结合了不匹配的催化发夹组装（MCHA）以实现低背景放大，并与CRISPR/Cas12a的切割反应相结合，同时采用微波辅助的干燥加热方法进行原位探针结合。与传统方法不同，我们的方法允许Cas12a直接切割未修饰的、非硫醇化的单链DNA（ssDNA）探针。在微波照射下，完整的探针通过其高亲和力结构域迅速与未修饰的AuNPs结合，形成保护层，防止盐诱导的聚集。相反，被目标激活的CRISPR/Cas12a切割的探针会失去这种结合能力，导致AuNPs聚集并产生可见的颜色变化。为了解决CRISPR反应和AuNP稳定性之间的矛盾离子要求，我们引入了Ba(OH)₂介导的离子重置步骤，在探针结合前去除多余的Mg²⁺。该平台能够在2小时内灵敏地检测到大肠杆菌 O157:H7，检测限为5 CFU/mL，并且在复杂的食品和临床样本中表现出稳健的性能。结合基于智能手机的RGB分析技术，这种仪器最小化的策略消除了对AuNPs化学修饰和专业操作人员的依赖，提供了一个多功能、低成本且用户友好的平台，非常适合资源有限的检测环境。

引言

大肠杆菌 O157:H7是最常见的食源性病原体之一，可产生志贺毒素，导致血性腹泻、溶血性尿毒综合征，甚至死亡，尤其是在婴儿和老年人中（Han等人，2024年；Petrucci等人，2022年）。低至10个活细胞的感染剂量就足以引起危及生命的症状，因此，灵敏且快速的大肠杆菌 O157:H7检测方法对于保障人类健康和安全至关重要（Zheng等人，2026年）。目前的检测方法包括基于培养的方法、基于分子生物学的方法和基于仪器的检测方法，这些方法耗时、操作复杂、劳动密集，并需要检测人员和设备（Fatah和Omer，2025年）。因此，开发一种快速、灵敏、准确、无需设备且易于使用的大肠杆菌 O157:H7检测方法具有重要的临床和社会经济意义，特别是在资源有限的条件下。这样的方法在多种实际场景中都有应用价值，例如现场筛查食品（如新鲜农产品、乳制品和即食食品）以防止疫情爆发，快速检测临床样本（如粪便样本）以促进及时诊断和治疗，以及在初级检测站或社区健康中心部署，这些地方往往缺乏先进的仪器。

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统已成为分子诊断和病原体检测的强大工具（Johnston等人，2025年；Lim等人，2025年）。CRISPR/Cas12a因其精确的目标DNA识别能力和强大的非特异性切割活性而特别有前景（Rananaware等人，2023年；Zhao等人，2024年）。为了达到痕量级检测，通常使用核酸扩增来提高灵敏度，但非特异性扩增会增加背景干扰（Broto等人，2022年；Lee等人，2024年）。此外，传统的合成荧光团-淬灭剂（FQ）基报告系统依赖于荧光检测，存在信号不稳定的问题，限制了定量精度和现场应用（Dighe等人，2024年；Huang等人，2025年）。因此，需要开发出稳健且定量的CRISPR方法，以解决扩增过程中的背景噪声问题和荧光检测的实际应用难题。

在无酶等温扩增方法中，催化发夹自组装（CHA）简单有效（Bari等人，2025年）。然而，传统的CHA方法常常受到发夹呼吸过程中随机链位移导致的显著背景泄漏的影响，这会降低特异性和可靠性（Mo等人，2025年）。为了解决这个问题，通过在发夹底物中的特定位置引入不匹配的碱基对，开发了不匹配催化发夹组装（MCHA）方法（Jiang等人，2014年）。优化研究表明，在发夹环附近的茎端引入双重不匹配可以有效抑制未催化的链交换，减少背景泄漏，同时保持催化效率（Zhang等人，2015年）。因此，MCHA的信号与背景比显著提高，从传统CHA的约4:1提高到优化后的MCHA设计的100:1以上（Jiang等人，2014年）。重要的是，MCHA产物可以合理设计，包含一个原间隔序列（PAM）和一个目标特异性序列，使其能够作为CRISPR/Cas12a的直接高效激活剂。这种高特异性MCHA预扩增与CRISPR/Cas12a切割级联的无缝结合，建立了一个稳健且特异性的扩增平台，用于灵敏检测细菌病原体。

此外，金纳米粒子（AuNPs）已被整合到CRISPR/Cas12a系统中，利用其大的摩尔吸收系数实现灵敏检测（Jiang等人，2021年）。在开创性研究中，CRISPR/Cas12a的切割特性被用来破坏两个DNA修饰的AuNPs之间的交联，使聚集的AuNPs分散，产生明显的颜色变化（Song等人，2024年；Zhou等人，2025年；Zhu等人，2024年）。其他方法利用CRISPR/Cas12a生成DNA信号，引导DNA-AuNP复合物在检测界面聚集，通过界面积累实现信号放大（Yuan等人，2023年；Zheng等人，2025a，Zheng等人，2025b）。然而，这些传统的CRISPR-AuNP颜色检测方法依赖于预先功能化的机制，这存在两个主要的基本和实际瓶颈。首先，它们通常基于繁琐且昂贵的AuNPs硫醇修饰，使实验方案复杂化并限制了可扩展性（Wang等人，2024年）。其次，AuNPs表面的共价结合ssDNA引入了显著的空间障碍，大大减缓了CRISPR/Cas12a的切割效率，与均匀溶液中的自由ssDNA相比（Dai等人，2019年；Fu等人，2021年；Sun等人，2025年）。这些机制限制表明，迫切需要从依赖化学修饰的检测方法转向根本不同的检测原理。迄今为止，只有一种无标记的系统被报道，该方法利用CRISPR介导的ssDNA切割来控制水凝胶中的AuNP生长（Fu等人，2025年）。然而，其对离子强度、pH值、温度和还原动力学的微小变化的敏感性较高，导致定量结果的可重复性和可靠性较低。因此，迫切需要一种能够规避硫醇修饰和空间障碍的稳健无标记策略。

结合这些概念，我们提出了一种新的策略，与预先功能化机制根本不同。在CRISPR反应之前，不是将探针与AuNPs结合，而是首先在溶液中用CRISPR/Cas12a切割未修饰的、非硫醇化的ssDNA探针，此时没有空间障碍，切割效率最高。然后通过微波（MW）辅助的干燥加热步骤，判断完整的探针是否可以通过其高亲和力结构域与未修饰的AuNPs结合。在微波照射下，水分迅速蒸发，增加AuNP表面的ssDNA浓度，促进饱和吸附和高密度标记（Huang等人，2022年；Wang等人，2024年）。ssDNA探针包含一个低亲和力的poly-T尾和一个高亲和力的poly-C区域。在微波脱水过程中，高亲和力区域与AuNP表面结合，而poly-T尾向外延伸，形成保护层，防止盐诱导的聚集并产生红色分散。我们假设被Cas12a切割的探针会失去这种结合能力，导致AuNPs聚集并产生可见的颜色变化。与现有的CRISPR-AuNP颜色检测方法相比，这种策略通过使用快速的3分钟微波处理而不是繁琐的过夜硫醇修饰，从根本上降低了操作复杂性（表S1）。关键的是，通过在原位结合之前先进行CRISPR反应，该设计完全规避了预先功能化系统中限制Cas12a活性的空间障碍。

在这里，我们开发了一种无标记的颜色检测平台来识别大肠杆菌 O157:H7（图1）。检测过程从适配体介导的目标识别开始，然后通过MCHA扩增生成双链DNA激活剂。这些激活剂触发Cas12a无差别地切割自由的T₁₀C₂₀ ssDNA探针。随后，引入Ba(OH)₂沉淀多余的离子（如Mg²⁺），创建一个低离子强度的环境。只有完整的、未降解的T₁₀C₂₀探针才能在随后的微波辅助干燥加热步骤中迅速与未修饰的AuNPs结合，保持红色分散。相反，被切割的探针无法提供保护，导致AuNPs聚集并产生蓝色变化，通过智能手机RGB读数进行定量分析。通过使用未修饰的AuNPs和易于获取的设备（常规微波炉和智能手机），该平台提供了一种快速、经济且高度灵敏的病原体筛查工具。

材料与方法

材料和实验步骤在支持信息中有详细描述。

MCHA-CRISPR/Cas12a-AuNPs/MW方法的检测机制

MCHA-CRISPR/Cas12a-AuNPs/MW方法的机制如图1所示。实验的工作流程如图S1所述。所提出的方法依赖于级联信号放大策略来检测大肠杆菌 O157:H7。目标细菌特异性结合到适配体上，释放触发链，激活MCHA过程，生成双链分子，触发CRISPR/Cas12a的切割。这种无差别的切割破坏了T₁₀C₂₀ ssDNA探针。

结论

总之，我们开发了一种新型的、仪器最小化的诊断平台，整合了MCHA扩增、CRISPR/Cas12a切割和无标记AuNP颜色检测技术，用于灵敏检测大肠杆菌 O157:H7。这项工作有效解决了当前CRISPR检测中的几个关键瓶颈，用快速、微波辅助的干燥加热结合策略替代了昂贵的硫醇修饰AuNPs或荧光团-淬灭剂报告系统。设计的MCHA系统有效

CRediT作者贡献声明

贾敏：概念构思、资金获取、方法学设计、资源管理、监督、初稿撰写、审稿与编辑。 如新宇：概念构思、数据管理、数据分析、方法学研究。 冰欣：数据管理、数据分析、方法学研究、审稿与编辑。 翟飞：数据管理、数据分析、方法学研究。 黄曼：数据管理、方法学研究、验证。 杜欣：概念构思、方法学设计、监督、撰写。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金 [资助编号 32001802]的财政支持。