《Biosensors and Bioelectronics》：Fluctuation-resilient ratiometric SERS enabled by programmable aptamer disassembly for pump-free microfluidic AKI detection
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急性肾损伤（AKI）早期评估受限于传统生物标志物检测延迟和异质性，本研究开发一种泵-free微流控aptamer-ratiometric SERS平台，可15分钟内同步检测NGAL和Cys C，检测限分别为1 pg/mL和34 pg/mL，R2>0.99，在动物模型和临床样本中验证有效。
Jin Qian|Zehang Tan|Yucan Zhang|Yibao Huang|Songzhe He|Guixin Shi|Juli Hong|Anhui Wang|Linlu Zhao|Ziyi Cheng
教育部热带医学创新与转化工程研究中心，药学院；教育部应急与创伤重点实验室；海南医学院第一附属医院重症监护科；海口571199，中国
摘要
急性肾损伤（AKI）需要快速可靠的生物标志物定量分析，然而在分散式检测条件下，早期评估受到生物标志物动力学延迟和信号波动的阻碍。本文开发了一种无泵微流控适配体比率增强拉曼散射（SERS）平台，用于同时定量中性粒细胞明胶酶相关脂钙素（NGAL）和半胱氨酸C（Cys C）。该检测方法利用Y形适配体结构将目标结合转化为程序化的结构解体和Au@Ag SERS标签的控制释放。嵌入底物的内部标准通过I1617/I2228比率实现自校准读数，从而提高信号对底物异质性和环境干扰的鲁棒性。该平台集成在毛细管驱动的微流控芯片中，可在15分钟内完成双生物标志物分析，NGAL的检测限为1 pg/mL，Cys C的检测限为34 pg/mL，线性度优异（R2 > 0.99）。在顺铂诱导的AKI大鼠模型中，这两种生物标志物在损伤后4-6小时显著升高，早于氧化应激成像和组织病理变化。临床血清样本的分析结果显示与酶联免疫吸附测定法结果一致，回收率超过99%。这些结果表明了一种快速可靠的早期AKI评估和定量即时检测生物标志物的方法。
引言
急性肾损伤（AKI）是一种快速发展的临床综合征，与较高的发病率、死亡率和医疗负担相关，其预后受早期识别和及时干预的强烈影响（Jha等人，2013；Ronco等人，2019）。然而，传统的临床指标如血清肌酐和尿量受到动力学延迟和生理变异性的限制，这限制了对肾损伤的早期和动态评估（Huang和Liu，2020；Kashani等人，2019）。分子生物标志物可以提供更早和机制相关的肾损伤信息。其中，中性粒细胞明胶酶相关脂钙素（NGAL）广泛用于反映肾小管应力和损伤，而半胱氨酸C（Cys C）是肾小球滤过改变的敏感指标。由于这两种生物标志物来源于不同的病理过程并表现出不同的释放特征，它们的同时定量可能在时间关键的条件下提供更全面的AKI进展评估（Cerda等人，2026；Pan等人，2022；Xu等人，2023）。这些考虑突显了需要能够进行快速、可靠和定量多生物标志物分析的即时检测（POCT）平台。
表面增强拉曼散射（SERS）因其高灵敏度、分子特异性和多重检测能力而非常适合POCT生物分析。先前的研究已证明其在定量临床检测和生物传感应用中的有效性（Cheng等人，2017；Shen等人，2021；Wang等人，2025）。然而，在实际应用中，定量SERS仍然具有挑战性，因为信号波动可能由异质电磁热点、纳米粒子聚集、基质效应以及仪器或环境变化引起，从而影响检测间的可比性（Schmidt等人，2023）。尽管通过底物优化、光谱平均和采集后校正可以部分缓解这些问题，但这些方法往往难以在分散式检测中标准化（Aradhye等人，2025；Liu等人，2024）。因此，比率增强SERS作为一种有效策略出现，通过引入内部标准实现自参考归一化（Cialla-May等人，2024）。最近的研究进一步表明，可靠的比率定量不仅取决于信号参考本身，还取决于传感结构是否能在非理想测量条件下将目标识别转化为可预测的信号变化（Lu等人，2024）。
适配体为构建此类可控信号转导界面提供了有希望的途径。作为通过SELEX选择的合成单链核酸，适配体具有批次间一致性、化学稳定性、易于修改以及与可编程核酸工程的兼容性（Lyu等人，2025）。特别是基于适配体的动态DNA组装可以将目标识别转化为定义明确的构象切换或链位移事件，从而实现可设计和可重复的信号输出（Chen等人，2022）。已有报道和实验验证了针对NGAL和Cys C的适配体，在复杂生物介质中具有良好的亲和力和选择性（Hong等人，2019；Kooshki等人，2019）。同时，微流控集成提供了提高检测速度、可重复性和操作简便性的额外途径。先前的研究表明，将SERS与微流控系统结合可以提高复杂样本的分析性能（Qian等人，2024；Liu等人，2022）。然而，许多现有设备仍依赖外部泵送和相对复杂的流体处理，这限制了它们在POCT中的适用性（Chen等人，2023）。相比之下，无泵微流控技术通过毛细管力和工程化通道结构实现自主液体传输，非常适合快速和用户友好的检测工作流程（Liu等人，2024；Olanrewaju等人，2018）。同时，由于在复杂生物流体中的生物传感仍受生物污染、非特异性吸附和不稳定界面行为的挑战，整体传感架构必须在实际条件下支持可控的结构响应和稳健的光学读数（Lee等人，2024；Karrat和Amine，2024）。
本文报道了一种无泵微流控适配体比率增强SERS平台，用于同时定量检测NGAL和Cys C，以实现快速AKI评估。该系统集成了Au@Ag SERS纳米标签、嵌入底物的内部标准和Y形适配体结构，将目标结合转化为程序化的结构解体。结合毛细管驱动的微流控技术，该设计实现了15分钟内的自主操作和抗波动的定量读数。该平台的分析性能在顺铂诱导的AKI大鼠模型和临床血清样本中得到了系统评估和进一步验证，证明了其在即时检测环境中快速可靠的AKI生物标志物分析潜力。
无泵微流控适配体SERS平台的工作原理
无泵微流控适配体SERS平台的工作原理如图1a-c所示。为了提高信号稳定性和避免光谱干扰，选择了4-巯基苯甲腈（4-MBN）作为内部标准，因为其在2228 cm-1的特征峰与MGITC在1617 cm-1的峰分离良好，且其紧凑的结构有助于在金属基底上形成稳定密集的单层（Lin等人，2024）。传感界面由此构建
结论
总结来说，我们开发了一种无泵微流控适配体比率增强SERS平台，用于AKI的双生物标志物快速分析。通过集成Y形目标响应探针、Au@Ag SERS标签、嵌入底物的内部标准和毛细管驱动的微流控技术，该平台实现了15分钟内的自主检测，并实现了NGAL和Cys C的敏感和可重复定量，检测限分别为1 pg/mL和34 pg/mL，线性度优异（R2 > 0.99）。
Au@Ag纳米颗粒的合成
制备好的Au纳米颗粒在室温下与0.1 mM MGITC孵育30分钟形成Au@MGITC。然后通过抗坏血酸介导的AgNO3还原生成银壳。简要来说，向5 mL的Au纳米颗粒溶液中加入100 mM抗坏血酸，再逐滴加入100 mM AgNO3。反应1小时后，以7000 rpm离心25分钟，然后重新分散在超纯水中。再次加入MGITC并孵育30分钟
CRediT作者贡献声明
Ziyi Cheng：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念构思。Linlu Zhao：撰写 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取。Jin Qian：撰写 – 原始草稿，方法学，研究，数据管理。Guixin Shi：正式分析，数据管理。Songzhe He：验证，软件。Anhui Wang：验证，正式分析。Juli Hong：撰写 – 审稿与编辑，方法学。Yibao Huang：方法学，正式分析。Yucan Zhang：撰写 –
未引用参考文献
Liu等人，2022；Liu等人，2024；Liu等人，2025；Wang等人，2024；Zhang和Winfree，2009。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号82202647、22064009、22305056）、海南省科学技术专项资金（ZDYF2026SHFZ061；ZDKJ2021038）、海南省自然科学基金（826YXQN0942、826QN0872）、海南省南海育才计划（南海创新人才，NHYCCX202502）、海南省健康科技创新联合计划（WSJK2025QN057）以及学术提升支持计划的支持。
