《Biosensors and Bioelectronics》：Surface enhanced Raman spectroscopy-based biosensor using nano-sculptured thin film to detect glial fibrillary acidic protein (GFAP) in blast-exposed moderately injured rat serum
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快速检测爆炸性脑损伤的生物标志物GFAP的银纳米结构薄膜表面增强拉曼光谱传感器研究。该传感器通过固定抗GFAP抗体于4-氨基苯硫酚修饰的银纳米结构薄膜实现高灵敏度检测，检测限达1 pg/ml，在三种爆炸性脑损伤大鼠血清中分别检测到15、24、37 pg/ml的GFAP浓度，且具有快速（<15分钟）、低样本量（3 μl）、便携等优势。
萨德娜·辛格（Sadhna Singh）| 阿尔蒂·亚达夫（Arti Yadav）| 帕尔金·阿罗拉（Palkin Arora）| 里查·特里维迪（Richa Trivedi）| 普里扬卡·夏尔马（Priyanka Sharma）| 萨钦·库马尔·斯里瓦斯塔瓦（Sachin Kumar Srivastava）
印度理工学院鲁尔基分校物理系，鲁尔基 247667，印度
摘要
为了防止神经损伤并实现有效治疗，特别是对于军事人员来说，需要快速、准确和早期诊断爆炸暴露引起的创伤性脑损伤（TBI）。本文开发了一种基于银纳米结构薄膜（nSTF）的表面增强拉曼光谱（SERS）生物传感器，用于检测TBI的生物标志物GFAP。该生物传感器芯片是通过将抗GFAP抗体固定在沉积在Si基底上的Ag-nSTF上的4-氨基硫酚（4ATP）上制备的。GFAP生物传感器的原理是利用4ATP的SERS信号强度增强效应。记录了不同GFAP浓度下传感器芯片的SERS信号。在PBS和添加GFAP的对照血清中，该传感器的检测限（LOD）达到了1 pg/ml。通过ELISA验证，三只遭受爆炸损伤但伤势较轻的大鼠血清中的GFAP浓度分别稀释1000倍后为15、24和37 pg/ml。进一步通过1000倍稀释的大鼠血清的盲测验证了传感器的性能，以预测是否有爆炸情况，结果与ELISA结果一致。所制备的传感器具有特异性、重复性和可重复使用性，同时体积小巧，分析物需求量少（3 μl），拉曼读数快速（500 ms），总响应时间<15分钟，优于ELISA。
引言
那些将生命奉献给军事服务的英雄们面临着多种健康问题，这些问题严重影响了他们的生活（Lee等人，2022年）。现代战争使军事人员面临多种可能导致TBI的情况，包括爆炸引起的创伤、车辆碰撞、穿透性头部损伤和战区事件（Supraja等人，2022年）。近年来，由爆炸装置产生的巨大冲击波导致爆炸性TBI的发病率迅速增加（Kumari等人，2023年）。遭受爆炸性TBI的军事人员经常出现认知缺陷、情绪不稳定和创伤后应激障碍等症状（Arun等人，2023年）。这种复杂性要求开发出能够准确快速识别爆炸性TBI生物标志物的改进诊断方法。TBI的严重程度从轻微到中度再到重度不等，每种情况都有其独特的特征和影响（Munjal等人，2010年）。轻度TBI，通常称为脑震荡，持续时间约为7-90天（Cancelliere等人，2023年）。中度TBI会干扰神经功能，可能导致长时间昏迷、记忆缺陷以及运动和沟通能力受损（Johnson等人，2023年）。重度TBI最为严重，会导致长时间昏迷、严重的认知障碍和长期残疾（Pease等人，2022年）。1974年由Graham Teasdale和Bryan Jennet开发的格拉斯哥昏迷量表（GCS）被广泛用于评估TBI的严重程度（Jain & Iverson，2023年）。目前，包括计算机断层扫描（CT）和磁共振成像在内的多种神经成像技术被用于检测TBI（Bigler，2001年；Le & Gean，2009年）。然而，这些方法存在局限性：设备成本高、在偏远地区应用受限、需要熟练的操作人员，以及潜在的辐射暴露风险。在TBI患者的血清中，表达有诸如泛素羧基末端水解酶L1（UCHL1）、GFAP、S100钙结合蛋白B（S100β）和神经特异性烯醇化酶（NSE）等蛋白质生物标志物（Dash等人，2010年；Singh等人，2018年）。GFAP是一种炎症生物标志物，是目前最常用的TBI检测目标蛋白（Khetani等人，2023年）。它可以在脑损伤后12小时内被检测到，并在48小时后达到最高水平。GFAP是一种细胞骨架蛋白，是中枢神经系统中成熟星形胶质细胞的主要纤维成分，以不可溶的单体蛋白形式存在，分子量为49.8–53千道尔顿（kDa）（Amalia，2021年）。迄今为止，已经开发出多种检测GFAP的生物传感器，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot、琼脂糖凝胶电泳和方波伏安法。这些方法成本高昂、耗时较长、需要大量样本，并且操作复杂（Lee等人，2022年；Supraja等人，2022年）。SERS是一种敏感的化学和生物医学分析技术。SERS通过使目标分子与等离子体纳米结构周围形成的高浓度局部场相互作用来增强拉曼信号（Jeanmaire和Duyne，1977年）。拉曼光谱代表了目标分子的“指纹”特征（Raman和Krishnan，1928年）。在共振条件下，当金属纳米结构的等离子体频率与入射电磁场的频率相匹配时，增强效果最为显著（Fu等人，2016年）。研究人员利用了各种含有纳米结构几何形状的SERS基底进行传感应用。通过电子束光刻技术制备的基底具有均匀性和有序性，但制造成本较高。胶体纳米粒子（如AuNPs、Au-Pd双金属纳米粒子、用巯基丙酸修饰的CdSe量子点）因其稳定性和生物相容性而被广泛研究，研究表明它们能灵敏地检测爆炸物和疾病生物标志物（Rani S.，2024年；Devi, S.等人，2018年；Devi, S.等人，2016年）。然而，胶体纳米粒子在SERS基底制备方面存在可重复性和均匀性问题。由银纳米棒（AgNRs）组成的纳米结构薄膜（nSTFs）提供了更强的可调LSPR效应，并具有均匀的热点分布，解决了胶体纳米粒子的这些问题（AuNPs）。通过掠射角沉积（GLAD）技术制备的nSTFs具有成本效益、可扩展性、高灵敏度（Gong等人，2015年）、高孔隙率（Jensen等人，2005年）、高粗糙度（Tait等人，1993年），支持纳米棒间隙中的高电场区域（Tait等人，1993年；Dirks等人，1997年；Yadav等人，2022年）、均匀性（Yadav等人，2025年），以及10^9的增强因子（Liu等人，2010年），使其适用于SERS生物传感应用（Abdulhalim等人，2014年）。GLAD技术通过调整倾斜角度、旋转和沉积速率等参数，可以制备出不同形状、大小和复杂几何结构的纳米柱状结构（Robbie等人，1997年）。Yeh等人开发了一种由金-银核壳纳米粒子组成的等离子辅助外延工程三维异质结构，具有精确调节的特性，适用于单分子检测（Yeh等人，2025年）。由金属有机纳米复合材料制成的可拉伸SERS基底已被用于即时诊断和可穿戴医疗应用。这些基底采用高效的等离子体工程方法制备，能够精确控制组成和定制光学性能（Yeh等人，2023年）。
在这项工作中，开发了一种基于nSTF的SERS生物传感器，用于检测TBI的生物标志物GFAP。本文的贡献如下：
- 1.
该生物传感器具有特异性、可重复使用性、稳定性和高均匀性等显著优势。
- 2.
该SERS生物传感器可实现TBI的快速诊断，从而通过早期诊断改善患者的生活，特别是军事人员的生活。
部分摘录
GFAP生物传感器的制备
首先，使用GLAD技术在85°的倾斜角度下制备了nSTF。为了验证85°的选择，通过COMSOL Multiphysics模拟了3个倾斜纳米棒的电场强度。nSTF的制备过程和模拟细节见补充材料（SM）的第S1节。为了制备GFAP生物传感器，将nSTF在4ATP溶液（1% w/w）中以90 rpm的速度在摇床中孵育45分钟，从而形成自组装的单层
SERS基底的表征
图1(b)中的FE-SEM图像（横截面和顶视图）展示了含有AgNRs阵列的Ag-nSTF的表面形态。插图显示了纳米棒的高度和直径的分布。使用ImageJ软件估计，AgNRs的平均直径和高度分别为91 nm和433 nm（Schneider等人，2012年）。为了实现λ/2的激发波长，制备了高度为433 nm的nSTF
结论
本文展示了一种用于检测GFAP的SERS生物传感器，GFAP是TBI的关键生物标志物。该传感器的检测限为1 pg/ml。实际应用中也通过检测PBS中的GFAP、添加GFAP的对照血清以及遭受爆炸损伤的大鼠血清中的GFAP来验证了该传感器的性能。发现三只遭受爆炸损伤但伤势较轻的大鼠血清中的GFAP浓度分别为15、24和37 pg/ml。由于该传感器的动态范围为1-50 pg/ml，因此也有潜力检测GFAP表达量较低的TBI病例
CRediT作者贡献声明
萨钦·库马尔·斯里瓦斯塔瓦（Sachin Kumar Srivastava）：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源管理、方法论、资金获取、概念构思。萨德娜·辛格（Sadhna Singh）：撰写 – 初稿撰写、验证、调查、数据分析。阿尔蒂·亚达夫（Arti Yadav）：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法论、调查、数据分析。普里扬卡·夏尔马（Priyanka Sharma）：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源管理、概念构思。帕尔金·阿罗拉（Palkin Arora）：验证、资源管理。
未引用的参考文献
Abdulhalim, 2014; Dirks and Leamy, 1997; Jensen and Brett, 2005; Rani et al., 2024; Robbie and Brett, 1997; Srivastava and Abdulhalim, 2023; Stiles et al., 2008; Wang et al., 2018.
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。致谢
作者感谢DRDO – 核医学与相关科学研究所（INM/TC/2519/CARS/02/2022）、印度政府科学与工程研究委员会（SRG/2020/002518）和科学技术部（TDP/BDTD/43/2021）的财政支持。萨德娜·辛格感谢印度教育部的研究奖学金。阿尔蒂·亚达夫感谢CSIR提供的资深研究奖学金。
