《Biosensors and Bioelectronics》：A complementary impedance spectroscopy biosensing method with graphene
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本研究针对传统石墨烯场效应晶体管生物传感器存在的迟滞、基线漂移及检测精度受限等问题，开发了一种基于液相栅石墨烯场效应晶体管和生物活性功能层的互补阻抗谱生物传感新方法。研究人员通过引入低频锁定放大技术，并提出了一个新的度量参数Y/X2，该参数在低频下与由石墨烯量子电容、电双层电容和功能层电容串联而成的有效电容成正比。该方法成功实现了对前列腺特异性抗原等生物标志物的高灵敏度、高特异性及高信噪比检测，展现出优异的基线稳定性，为开发稳健、可扩展的生物电子传感应用提供了新路径。
在精准医疗的时代，对生物标志物的快速、灵敏检测是疾病早期诊断和健康监测的关键。石墨烯，这种由碳原子构成的单层二维材料，因其优异的电学性能和巨大的比表面积，被视为构建下一代生物传感器的理想平台。特别是石墨烯场效应晶体管，能够将发生在石墨烯通道附近的分子相互作用直接转换为电信号，实现无标记检测，吸引了广泛关注。然而，梦想照进现实的道路并非一片坦途。现有的基于直流电阻测量的GFET生物传感器，在实际应用中常常受到电荷俘获导致的迟滞、随时间变化的基线漂移等问题的困扰。这些不稳定性严重影响了检测的精度和可靠性。另一方面，传统的电化学阻抗谱技术虽能提供丰富的界面信息，但对实验条件和设备要求苛刻，且成本较高。那么，能否找到一种方法，既能继承EIS高信息量的优点，又能规避GFET直流测量的不稳定性，从而实现更稳健、更灵敏的生物传感呢？
来自瑞典查尔姆斯理工大学的Munis Khan、Ivan Mijakovic、Santosh Pandit和August Yurgens研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》上发表的研究，给出了一种创新的解决方案。他们提出并验证了一种“互补”的电化学阻抗谱生物传感方法。这项研究的核心在于思维转换：不同于传统EIS让电流垂直穿过电解液和电极界面，他们让交流偏置电流横向流过与生物功能层直接接触的石墨烯薄膜本身。通过测量石墨烯通道的复阻抗（表示为X+iY），并结合专门设计的功能层，来感知分析物结合事件。更巧妙的是，他们从电路模型中推导出一个新颖的度量——Y/X2。理论分析表明，在低频条件下，这个比值与系统的有效电容（C）直接相关，而该有效电容是石墨烯量子电容（Cq）、电双层电容（Cdl）和生物功能层电容（Cf）三者串联的结果。这个新参数对分析物引起的电容变化极为敏感，同时对基线漂移具有出色的稳定性，为高可靠性的生物传感打开了一扇新大门。
为开展这项研究，研究人员主要采用了以下几个关键技术方法：首先，他们利用化学气相沉积和热压层压技术，在柔性衬底上制备了石墨烯液相栅场效应晶体管器件。其次，通过非共价π-π堆叠作用，将1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯连接分子修饰到石墨烯表面，进而通过碳二亚胺交联化学固定前列腺特异性抗原抗体，构建了高特异性的生物传感界面。最后，也是最具特色的，他们建立了一套低频锁定放大测量系统，对器件施加交流偏置，并同步记录阻抗的同相分量X和正交分量Y，进而计算得到关键传感参数Y/X2，用于实时监测分析物结合过程。
研究结果部分主要包括以下内容：
2. 材料与方法
本研究详细阐述了基于抗体功能化GFET的生物传感器设计与制备。该传感器将人KLK3/前列腺特异性抗原抗体的高特异性与GFET的高灵敏度探测能力相结合。制备过程涉及多个阶段的常规微加工工艺，随后通过分子连接物进行表面非共价功能化，该连接物通过π-π堆叠相互作用与石墨烯表面结合。PSA抗体通过碳二亚胺交联化学固定在石墨烯通道上。为了最大限度地减少非特异性吸附，石墨烯表面进一步用氨基-PEG5醇和盐酸乙醇胺封闭。电学测量在低离子强度的0.001×PBS溶液中进行，以避免电荷屏蔽效应。测量采用交流偏置和低频锁定放大器，记录电压的同相和正交分量，以推导传感器电路阻抗的X和Y分量。研究人员将GFET建模为一个电阻和电容组件网络，代表了分布式Randles等效电路的集总元件近似。石墨烯-电解质界面被建模为三个串联电容的组合：出现在带电电极和流体之间界面的双电层电容Cdl、由抗体和表面封闭分子组成的生物功能层电容Cf，以及解释石墨烯电极态密度随费米能级变化而必须考虑的量子电容Cq。从模型方程中，他们发现了Y/X2这一度量，在足够低的频率下，它与有效电容C成正比。
3. 结果与讨论
3.1. 锁定放大测量
测量了在引入分析物前后X和Y随栅压Vg的变化。X的偏移表明沟道电阻Rch的变化，可能由分析物结合引发的电荷转移引起。Y的偏移包含了有效电容C的变化。与X的变化相比，Y的变化更为显著，表明传感响应中存在很大的电容分量。使用新度量Y/X2(Vg)进行分析发现，与X(Vg)和Y(Vg)的强非线性行为相比，Y/X2在整个Vg范围内几乎保持恒定，这突显了Y/X2在分离与生物分子结合相关的电容变化方面的效用。时间序列测量进一步验证了这一度量。将Vg固定在跨导峰值点并连续监测X、Y和Y/X2，结果显示X存在显著的漂移，模糊了添加分析物的响应；相反，Y/X2提供了稳定得多的基线，因此响应更清晰，并表现出更高的信噪比，且对Vg的依赖性最小。选择性测试表明，针对PSA功能化的GFET仅对目标分析物（PSA）表现出明显的响应，而对非目标蛋白牛血清白蛋白的响应可忽略不计，证实了其特异性。灵敏度测试显示，该传感器能够可靠地检测低至50 pg/mL（约1.6 pM）的PSA浓度，信噪比高，远低于前列腺癌筛查中通常关注的阈值，证明了其高灵敏度。
3.2. 频率相关的阻抗响应
研究表明，Y/X2对相同分析物浓度在较高频率下的响应大幅增加，这可归因于界面电容变化在更高频率下占主导地位。时间序列测量显示，Y/X2的偏移随频率增加而增加。此外，在较高频率下观察到X偏移方向的反转，而Y的偏移先从低频率增加，在375 Hz及更高频率后又开始减少。观察到的行为可能是由于电解质-石墨烯界面的非理想性质。尽管如此，GFET生物传感器在1000 Hz下仍然保持高选择性，对PSA响应强，对BSA响应几乎可忽略。最后，将1000 Hz下的Y/X2响应与传统的石墨烯电阻直流测量进行比较，发现锁定放大测量的响应远远超过直流方法可检测到的范围，突显了基于频率的检测在灵敏度和稳健性方面的优势。
结论与讨论
本研究成功引入了一种用于生物传感的互补电化学阻抗谱方法。在该方法中，交流偏置电流通过直接与生物功能层接触的石墨烯，而不是像传统EIS那样通过电解质。生物功能层可以被设计成在特定分子结合时发生明确的变化，传感器阻抗的同相（X）和正交（Y）分量提供了关于这些变化的丰富信息。新发现的度量Y/X2有效地分离了生物功能层和相邻电解质双电层电容的变化。利用石墨烯液相栅晶体管生物传感器，即使在低分析物浓度下也能可靠地检测到特定的抗体-抗原结合。传感器响应不受在依赖传统直流电阻测量的石墨烯生物传感器中常观察到的噪声和基线漂移的影响。需要强调的是，目前的验证是在低离子强度条件下进行的，其中德拜长度足够大以实现有效的信号转导。因此，此处展示的性能尚不能推广到生理或其他高离子强度环境。未来的工作将明确针对将此法扩展到更高离子强度的介质。最重要的是，该方法不仅限于石墨烯生物传感器。它可以广泛应用于任何具有足够高方块电阻的导电薄膜。这种多功能性通过实现电阻膜材料与抗体或其他功能分子之间化学连接剂的定制设计，扩展了潜在生物传感平台的范围。这项工作为开发更稳健、可扩展且可能成本更低的生物电子传感设备提供了新的思路和实用途径。
