池化CRISPR筛选技术有助于在工业微生物中建立基因型与表型之间的关联

《Biosensors and Bioelectronics》：Pooled CRISPR screening enables genotype–phenotype association in industrial microorganisms

CRISPR筛选辅助的基因-表型关联研究为解析工业微生物高效生产机制提供了系统方法，涵盖设计-构建-筛选-应用全流程，通过比较基因编辑技术与高通量筛选策略的优劣，结合AI优化工作流，加速了高附加值微生物菌株的理性设计。

　　

丁一凯|吕子伟|罗诺|丁金燕|赵光荣|王萌|张月

天津大学国际联合研究所，中国天津300072

摘要

工业微生物结合了基因组的稳健性和工艺的适应性，以实现高水平的生物生产，而这些特性通常由复杂的多基因相互作用所控制。最近兴起的一种方法——基于CRISPR技术的基因型-表型关联（GPA）筛查辅助技术，正逐渐成为一个强大的平台，用于系统地研究工业相关菌株的基因功能，并快速识别能够产生所需表型的基因型。在这篇综述中，我们将GPA的工作流程定义为“设计-构建-筛查-应用”，并重点关注其中中间两个步骤。我们比较了最先进的文库构建技术，并总结了使用多种富集和筛查策略获得的阳性结果，评估了它们的优势、局限性和适用性。随后，我们总结了过去五年中的相关应用案例，以说明GPA如何揭示工业相关的特性并加速高性能微生物细胞工厂的构建。最后，我们探讨了人工智能（AI）如何简化基于CRISPR的GPA工作流程，并指出了仍存在的挑战。

引言

像大肠杆菌、酿酒酵母和谷氨酸棒状杆菌这样的工业微生物被广泛用于大规模生产食品成分、燃料、化学品、酶和药品（Becker等人，2018年；Buchholz和Collins，2013年；Luttik等人，2008年；Wendisch等人，2006年）。为了满足工业需求，这些微生物需要具备优异的特性，包括快速生长、高产量、高效分泌、高遗传稳定性和广泛的底物谱（Park和Ledesma-Amaro，2023年；Rzechonek等人，2017年；Zhang等人，2018年）。此外，它们经常面临诸如高底物/产物浓度、有毒副产物、低pH值、极端温度和高渗透压等压力，因此必须在复杂的发酵环境中表现出强大的耐受性和稳健性（Luo等人，2025年；Wan等人，2024年；Xu等人，2019年）。对于微生物来说，任何可观察到的表型（包括生长、底物消耗、目标代谢产物的产生或毒素耐受性）都由其基因型决定。然而，工业微生物的优异特性通常不是由单一的遗传因素决定的，而是基因组内容与工艺条件之间复杂相互作用的结果，并受到多个基因的协同调控。控制转录的复杂细胞内网络，以及转录后和翻译修饰、蛋白质-蛋白质相互作用和动态代谢流，使得基因型到表型的映射高度非线性，难以用简单的预测模型来描述。

基因型-表型关联（GPA）指的是遗传变异与相应表型特征之间的内在相关性，这是现代生物学中的一个关键研究方向（Feng等人，2021年）。揭示这一联系有助于我们深入理解基本的细胞过程，并提供改进工业微生物、提高产量和探究进化机制所需的理论框架和分子工具。基于CRISPR技术的基因型-表型关联筛查为系统研究工业相关微生物的基因功能以及高效识别目标表型背后的基因型提供了一个多功能平台。在这种情况下，GPA研究通常遵循“设计-构建-筛查-应用”的循环（图1）。首先，在计算机上设计针对与期望表型相关的基因组规模基因（或其选定子集）的引导RNA（gRNA），然后在芯片上合成并组装成寡核苷酸池。其次，使用可扩展的CRISPR工具生成高多样性的微生物文库，这些工具主要分为两类：不可逆的基因组变异（如CRISPR介导的基因删除CRISPRd和CRISPR碱基编辑CRISPR-BE），以及可逆的表达扰动（如CRISPR干扰CRISPRi和CRISPR激活CRISPRa）。第三，根据预期的基因型、微生物类型和关注的生物学问题，采用各种筛查和富集方法来筛选文库并识别有益的变体。最后，通过深度测序量化gRNA的适应性，鉴定相关基因位点，并对相应的基因型进行验证和重组，以生成具有所需特性的生产菌株。

在过去十年中，DNA测序和基因组编辑技术的显著进步将GPA研究推进到了全基因组时代。下一代测序（NGS）平台现在能够以前所未有的速度和成本效益提供工业微生物的全基因组数据（Dixit等人，2016年），而CRISPR工具包则实现了精确的多重基因组规模遗传修饰和转录扰动（Adiego-Perez等人，2019年；Qi等人，2013年）。互补的高通量表型技术，例如荧光激活细胞分选（FACS）（Garg等人，2024年）和荧光激活液滴分选（FADS）（Tran等人，2013年），可以快速量化数百万个变体，从而消除了基因型与表型之间的筛选瓶颈。总体而言，这些创新将GPA研究从逐位点调查转变为系统级的、核苷酸分辨率的映射。

在这篇综述中，我们重点介绍了基于CRISPR技术的基因型-表型关联筛查的工作流程，特别是“构建”和“筛查”两个步骤。在构建方面，我们比较了使用CRISPRd、CRISPRi、CRISPRa和CRISPR-BE技术生成的文库。在筛查方面，我们总结了使用生长耦合筛查、直接读取检测、FACS和FADS方法获得的阳性结果。在前两节中，还讨论了每种技术在GPA研究中的适用性、优势和局限性。随后，我们通过过去五年中在各种微生物中的应用案例来说明GPA如何揭示工业相关的特性并加速高性能微生物细胞工厂的构建。最后，我们讨论了人工智能（AI）如何简化基于CRISPR的GPA工作流程，并指出了仍存在的挑战。

部分摘录

用于文库构建的CRISPR技术

CRISPR/Cas系统是原核生物中广泛存在的适应性免疫机制，表现出丰富的遗传和功能多样性（Jinek等人，2012年）。它已被重新设计成一个多功能、可编程的平台，用于基因编辑和表达调控。其中，来自化脓性链球菌的Cas9系统因其良好的性能和在许多微生物中的广泛应用而成为基于CRISPR的文库构建的主要工具。

GPA研究中的高通量筛查技术

为了高效地进行阳性结果筛选，GPA研究中通常使用几种高通量技术，这些技术根据实验原理和实施要求大致分为四类：生长耦合筛查、直接读取检测、FACS和FADS。方法的选择主要基于目标表型（生长、耐受性和产量）和微生物特性（单细胞细菌或丝状微生物）。

在代表性工业微生物中的基于CRISPR技术的基因型-表型关联研究

基于CRISPR技术的基因型-表型关联筛查已应用于多种工业相关的微生物，包括经典的模式物种和作为微生物细胞工厂的新兴菌株（表1）。对于传统宿主，GPA为这些已有数十年历史的微生物提供了新的见解；对于新的候选菌株，它通过提供其遗传背景和代谢调控的全面信息，加速了高性能菌株的开发。

AI辅助的GPA研究简化

基于CRISPR的GPA研究本质上需要大量数据：在文库构建、高通量筛查和NGS过程中会产生大量数据，这些过程严重依赖于计算工具。近年来，这些技术显著改变了生物学研究范式，使GPA研究的每个步骤都更加快速和准确。下面我们回顾了AI在（i）文库构建（尤其是gRNA设计）和（ii）高通量方面的应用。

结论与展望

总体而言，基于CRISPR技术的基因型-表型关联筛查为解析工业重要表型提供了一个高效的平台，无需对微生物有全面的先验知识，从而可以直接进行具有改进特性的菌株工程。然而，仍存在一些实际瓶颈和概念性挑战。首先，当文库构建依赖于表达扰动时，基于CRISPR的筛查经常会出现较高的假阳性率。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2024YFC3407100）、国家自然科学基金（32200043）、天津市自然科学基金（25JCYBJC00700）和中国科学院青年创新促进会（2023187）的支持。