《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Deep tumor access via tumor-specific mannose unmasking: smart heptamannosylated β-cyclodextrin nanoassembly
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本研究设计了一种基于肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的pH激活型纳米递送系统（Dox@CD-Pep），通过苯硼酸-邻二醇酯键实现循环中的稳定性和酸性肿瘤微环境的可控释放。该系统通过TAM介导的主动运输穿透致密肿瘤基质，释放紫杉醇与抗PD-L1肽段协同增强化疗免疫治疗效果，在4T1和Pan02模型中分别实现43.4%的肿瘤抑制率和显著免疫微环境重塑。
Kai Hua|Xiuqi Li|Yanyan Pan|Zhenyi Li|Die Li|Jingtao Zheng|Yubin Chen|Jiahao Liu|Qihui Wang|Yuan Li|Jing Zhang|Yongzhong Du|Yun Zhu|Tongyu Li|Qiang Zhang|Weishuo Li
南京工业大学环境与生物工程学院分子代谢中心，中国南京市小灵圩街200号，210094
摘要
肿瘤驻留免疫细胞，如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），具有天然的肿瘤穿透能力，并且能够主动将外渗的治疗药物通过密集的肿瘤基质输送到深层肿瘤细胞中，从而消除这些细胞。受此机制的启发，我们设计了能够“搭便车”的纳米载体（“纳米搭便车者”）用于深层肿瘤药物输送。这些纳米搭便车者由负载多聚糖化β-环糊精和多柔比星（Dox）的纳米颗粒组成，通过苯硼酸末端的抗PD-L1肽进行交联，直径约为100纳米。通过与靶向TAM的配体上的邻二醇形成硼酸酯，在系统循环过程中使纳米搭便车者保持惰性。当这些纳米颗粒在酸性肿瘤微环境中积累时，硼酸酯在酸的作用下水解，释放出 mannose，从而实现与TAM的主动结合。随后，TAM介导的运输将Dox输送到深层肿瘤区域，在静脉注射后24小时内即可达到深层渗透效果。从TAM中释放出的Dox表现出强烈的细胞毒性和显著的免疫细胞死亡效应。当与原位释放的抗PD-L1肽协同作用时，在4T1模型中的抗肿瘤效果达到了43.4%。此外，这种深层输送策略成功重塑了免疫抑制性微环境，表现为CD8+ T细胞浸润增加了3倍，树突状细胞成熟度显著提高（46.7±0.76%）。最终，这种化学免疫疗法在4T1模型中实现了显著的肿瘤生长抑制，在富含基质的Pan02模型中也展现了良好的治疗效果。我们的工作展示了一种利用内源性免疫细胞进行深层肿瘤精准清除的原位激活系统。
引言
根除位于肿瘤核心区域的肿瘤细胞对于成功的肿瘤治疗至关重要，因为这些细胞在维持肿瘤恶性进展中起着关键作用[1]。然而，由于缺乏血管、密集的细胞外基质（ECM）以及较高的间质液压力（IFP），治疗药物难以到达隐藏在密集基质中的肿瘤细胞[3],[4]。近年来，人们尝试多种方法来靶向并杀死深层肿瘤细胞[5],[6],[7]。基于纳米药物主要通过尺寸依赖性被动扩散进入肿瘤的普遍假设，已经开发出多种可切换尺寸的纳米药物[8],[9]。这些纳米药物进入肿瘤组织后，会缩小或分解为更小的颗粒（小于30纳米[10],[11]），从而被动渗透到深层肿瘤。尽管这些尺寸变化的纳米药物提高了渗透深度，但它们容易被肿瘤清除，导致抗肿瘤效果减弱[12],[13]。除了可切换尺寸的纳米药物外，还研究了表面电荷反转的纳米药物。这类药物在血液中呈负电荷，在肿瘤部位呈正电荷，从而触发多细胞转胞吞作用，实现深层渗透[14],[15]。然而，细胞内的蛋白质冠层可能会影响药物的细胞内分布和随后的外排过程，从而降低渗透效率[16]。因此，开发具有高肿瘤穿透效率的纳米药物仍然十分必要。
肿瘤驻留免疫细胞具有天然的肿瘤穿透能力，有望主动将外渗药物通过密集的肿瘤基质输送到深层肿瘤细胞中[17],[18]。例如，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）占肿瘤质量的50%[19],[20],[21]，存在于肿瘤的整个区域，从外围到核心[22],[23]。研究表明，TAMs能够向肿瘤床中渗出的金纳米颗粒迁移，并以尺寸依赖性方式将其输送到深层肿瘤区域[24]，即TAMs更倾向于运输较大的渗出纳米颗粒。此外，TAMs还被用作肿瘤中的持续药物释放库[25],[26]。尽管TAMs作为药物载体的潜力巨大，但据我们所知，目前还没有研究利用TAMs将药物输送到深层肿瘤细胞的研究。
基于以上考虑，我们设计了能够在原位激活的纳米搭便车者，将药物输送到深层肿瘤。这些纳米搭便车者由经过mannose修饰的环糊精和多柔比星组成，通过两端带有苯硼酸的短抗PD-L1肽进行交联。苯硼酸与mannose上的邻二醇形成的硼酸酯在系统循环过程中锁定了纳米搭便车者的“搭便车”能力。当这些纳米颗粒在酸性肿瘤环境中积累时，硼酸酯被水解，暴露出 mannose，使TAM能够主动将环糊精-Dox输送到深层肿瘤，并引发免疫细胞死亡。与释放的抗PD-1肽协同作用时，实现了深层肿瘤的增强化学免疫治疗效果。我们的系统提供了一种原位激活策略，可以选择性地利用TAMs实现深层肿瘤的精准治疗。
Dox@CD-Pep的设计、制备与表征
这些纳米搭便车者是由经过mannose修饰的环糊精（M-β-CD）与两端带有苯硼酸的短抗PD-L1肽（diPBA-Pep）交联而成的。多聚糖化β-环糊精（Man7-β-CD）的合成方法如先前报道（图S1-5）[27]，diPBA-Pep则是通过叠氮化物-Pep和炔烃-PBA之间的点击化学反应合成的（图1A）。diPBA-Peb的化学结构通过质子核磁共振光谱（1H-NMR）和傅里叶变换红外光谱进行了验证
讨论
我们利用肿瘤驻留免疫细胞天然的肿瘤穿透能力，设计了能够主动将外渗治疗药物通过密集肿瘤基质输送到深层肿瘤细胞的纳米载体。这些纳米搭便车者包含一个mannose基团，作为高亲和力的TAM识别和结合配体，其邻二醇部分通过与末端带有苯硼酸的短抗PD-L1肽形成酯键。硼酸酯在酸性环境中容易水解
化学试剂
2,2-联吡啶、N,N-二甲甲酰胺、苯硼酸、L-抗坏血酸钠盐、mannose和硫酸铜五水合物均购自上海Aladdin生化科技有限公司。短抗PD-L1肽（叠氮化物-Pep）由Dan Gang生物科技有限公司（武汉，中国）提供。二甲基亚砜和氘代二甲基亚砜来自元叶生物科技有限公司（上海，中国）。β-环糊精和多柔比星盐酸盐则从Depaer生物科技有限公司获得作者贡献声明
Weishuo Li：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，概念构思。Die Li：方法学研究。Jingtao Zheng：实验研究。Yubin Chen：实验研究。Jiahao Liu：实验研究。Qihui Wang：数据可视化。Yuan Li：数据可视化。Jing Zhang：实验研究。Kai Hua：撰写 – 原稿，数据可视化，方法学研究，实验研究。Yongzhong Du：项目指导。Yun Zhu：撰写 – 审稿与编辑，概念构思。Xiuqi Li：数据可视化，方法学研究。Tongyu Li：撰写 – 审稿与利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：22175091）、江苏省杰出青年科学基金（编号：BK20220140）、国家先进药物输送与释放系统重点实验室（项目编号：DSQZ-QN-202301）以及宁波市自然科学基金（编号：2023J384）的支持。
