《Fish & Shellfish Immunology》：Development of an antigen-specific CD4-1+ T cell response assay based on cytokine gene expression in ginbuna crucian carp (Carassius auratus langsdorfii)
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抗原特异性T细胞反应评估与细胞因子表达研究。通过开发体外重刺激试验，验证了金鱼藻锦鲤肾脏淋巴细胞在植物血凝素（PHA）刺激下显著上调ifng1、ifng2、il4/13a和il4/13b等细胞因子表达，并证实CD4+1+T细胞介导的免疫应答与血浆IgM抗体水平呈正相关。该系统可区分不同佐剂诱导的细胞因子谱差异，为鱼类适应性免疫研究提供新方法。
武田信二|上原怜|奥库大智|金子彩音|船木香织|片倉文彦|森本忠明
日本大学兽医学系比较免疫学实验室，神奈川县藤泽市龟井野1866，252-0880，日本
摘要
抗原诱导的细胞因子产生是T细胞激活的功能性指标。在本研究中，我们开发了一种实用的体外再刺激实验方法，用于评估锦鲤（Carassius auratus langsdorfii）中的抗原特异性T细胞反应。用植物血凝素刺激肾脏白细胞显著上调了ifng1、ifng2、il4/13a和il4/13b基因的表达，这支持了它们作为T细胞激活指标的用途。在特定的培养条件下，用相同的抗原重新刺激抗原敏感的肾脏白细胞会显著上调细胞因子基因的表达，尤其是ifng1和il4/13b。从再刺激培养物中分离出的CD4+细胞表现出T淋巴细胞的特征，并且ifng1和il4/13b的表达增加，表明抗原诱导的细胞因子反应主要由辅助T细胞介导。抗原诱导的细胞因子表达与适应性免疫的程度相关，这一点通过时间分析和加强免疫期间的血浆IgM滴度得到了体现。此外，不同的佐剂处理后观察到了不同的细胞因子谱型。这些发现建立了一种实用的基于细胞因子的方法，用于评估硬骨鱼中的抗原特异性CD4+ T细胞反应，并为未来关于鱼类适应性免疫和疫苗评估的研究提供了基础。
引言
T细胞是一类通过抗原特异性识别来协调适应性免疫反应的关键白细胞。在外周免疫系统中，T细胞大致分为辅助T细胞和细胞毒性T细胞亚群，它们分别通过表达CD4和CD8糖蛋白来区分。在哺乳动物中，CD4+辅助T（Th）细胞通过作为效应细胞和记忆细胞来调节免疫反应，同时参与宿主防御和免疫病理过程。初次接触抗原后，天真的CD4+ T细胞分化为功能不同的效应亚群。例如，Th1细胞产生干扰素（IFN）-γ以支持细胞免疫，而Th2细胞产生白细胞介素（IL）-4和IL-13以促进体液免疫[1]。这些例子突显了细胞因子在介导Th细胞功能中的重要性。一部分激活的Th细胞会持续存在为长寿的记忆细胞，它们在后续遇到抗原时能够迅速反应并产生次级效应细胞[2]。因此，在初次和二次免疫反应中产生的效应Th细胞在抗原刺激下会迅速产生细胞因子，使得细胞因子产生成为T细胞激活的关键功能指标。
测量T细胞产生的抗原诱导细胞因子已成为诊断传染病、评估免疫状态和评估疫苗诱导免疫的重要工具。这些实验已在人类和兽医医学中得到广泛应用；例如，在结核病研究中，将感染个体的全血与分枝杆菌抗原一起培养，并定量IFN-γ的产生情况以评估感染状态[3]，[4]。同样，在登革热疫苗研究中，用登革热病毒抗原体外刺激接种者的外周血单核细胞（PBMCs），并通过流式细胞术分析产生IFN-γ的CD4+ T细胞的频率，以此作为疫苗诱导的细胞免疫的指标[5]。最近，在SARS-CoV-2 mRNA疫苗研究中，基于全血或PBMC的抗原刺激实验被广泛用于量化多种T细胞相关细胞因子的产生，从而全面评估疫苗引发的免疫反应[6]。总体而言，这些研究表明，抗原诱导的细胞因子产生是评估哺乳动物T细胞介导的免疫的一个可靠且实用的功能指标。
硬骨鱼拥有保守的基因，编码参与T细胞免疫的分子，如αβ T细胞受体（tcra和tcrb）、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（lck）、CD8（cd8a和cd8b）以及CD4同源物（cd4-1和cd4-2）[7]。此外，已在几种硬骨鱼物种中鉴定出与T细胞相关的细胞因子，包括IFN-γ（ifng1和ifng2[8]，[9]以及IL-4/13同源物（il4/13a和il4/13b[10]，[11]，表明Th细胞介导的免疫的关键成分在脊椎动物中是保守的。尽管Th1/Th2范式在哺乳动物中已经明确，但在硬骨鱼中Th细胞的极化尚未完全明确。在这种情况下，细胞因子表达通常被用作功能性指标，而不是作为明确的谱系标记。功能研究表明，这些细胞因子可以像哺乳动物中的对应物一样主动调节免疫反应。例如，重组IFN-γ可以刺激金鱼（Carassius auratus）的巨噬细胞，上调促炎细胞因子的基因表达并增强吞噬作用和呼吸爆发活性[12]，而重组IL-4/13B可以促进鲤鱼（Cyprinus carpio）肾脏和脾脏白细胞中IgM+ B细胞的增殖[13]。此外，几种硬骨鱼物种中CD4+ T细胞的功能也已被表征[14]，[15]，[16]，[17]，[18]，[19]。例如，在河豚（Takifugu rubripes）中，用T细胞丝裂原ConA刺激外周血白细胞可以诱导CD4+ T细胞中T细胞相关细胞因子基因（包括ifng和il4/13）的强烈表达[15]。在锦鲤（Carassius auratus langsdorfii）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）中，当用相同抗原培养抗原免疫鱼的白细胞时，观察到CD4+ T细胞的抗原特异性增殖和T细胞相关细胞因子基因的表达[14]，[20]。在斑马鱼（Danio rerio）中，表达荧光cd4-1+细胞的转基因品系在二次免疫使用人γ球蛋白（HGG）后显示出肾脏和脾脏白细胞中的抗原诱导细胞因子基因表达[21]。此外，在虹鳟中，已经研究了使用外周血或头部肾脏白细胞进行淋巴细胞增殖实验的最佳条件，包括丝裂原类型、培养时间和温度，作为评估T细胞介导的免疫反应的工具[22]。这些研究共同表明，硬骨鱼的CD4+ T细胞可以以类似于哺乳动物Th细胞的方式对抗原作出反应，并协调适应性免疫[23]。
尽管取得了这些进展，但至今尚未建立一种简单实用的实验方法来评估硬骨鱼中的抗原特异性T细胞反应。如上所述，在哺乳动物中，抗原诱导的细胞因子产生是T细胞激活的可靠功能指标，可以评估效应细胞和记忆细胞的反应。将这种方法应用于鱼类将允许直接评估抗原特异性T细胞的功能。锦鲤是一种成熟的硬骨鱼模型，具有克隆特性、可用的分子标记物，以及先前关于抗原特异性CD4+ T细胞反应的证据[14]，[24]。因此，在本研究中，我们旨在建立一种实用的实验系统，用于评估锦鲤中的抗原特异性CD4+ T细胞反应，该系统基于用相同抗原培养的白细胞中T细胞相关细胞因子基因的表达。我们进一步评估了该系统是否能够反映不同免疫策略诱导的适应性免疫反应的程度和质量。
实验部分
鱼类
本研究中使用了在我们实验室通过连续几代雌核生殖技术维持了20多年的三倍体克隆锦鲤（Carassius auratus langsdorfii，OB1品系）。这些鱼体重在20-40克之间（1-3岁），饲养在装有过滤水循环系统的鱼缸中，光照时间为12小时：黑暗时间为12小时，每天喂食颗粒状干饲料（EP-1，Marubeni Nissin Feed Co., Ltd.，日本）。
PHA刺激诱导的肾脏白细胞中的细胞因子基因表达
为了检测在锦鲤中鉴定出的细胞因子基因（特别是ifng1、ifng2、il4/13a和il4/13b）是否在T细胞中表达，我们用T细胞丝裂原PHA、B细胞丝裂原LPS和病毒模拟物poly(I:C)刺激肾脏白细胞。与PBS处理的对照组相比，PHA刺激显著增加了所有检测到的细胞因子基因的表达（图1）。相比之下，LPS刺激增加了ifng1和ifng2的表达水平，尽管
讨论
在本研究中，我们开发并验证了一种基于细胞因子的体外再刺激实验方法，用于评估锦鲤中的抗原特异性CD4+ T细胞反应。尽管抗体滴度被广泛用作硬骨鱼适应性免疫的指标，但评估抗原特异性T细胞反应的方法仍然有限。通过关注抗原诱导的T细胞相关细胞因子基因的表达，本研究为评估Th样细胞免疫提供了一个实用的框架
伦理声明
所有动物实验均按照当地和国家关于动物福利和管理的法规以及国家研究委员会发布的《实验室动物护理和使用指南》第8版进行。
作者贡献
武田信二：方法学、研究、验证、数据分析、可视化、撰写 - 原稿。上原怜：研究、数据分析。奥库大智：研究、数据分析。金子彩音：研究、验证。船木香织：研究、验证。片倉文彦：撰写 - 审稿与编辑、资源提供、监督、项目管理、概念构思、资金获取。森本忠明：撰写 - 审稿与编辑、资源提供，
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本手稿期间，作者仅使用DeepL和ChatGPT进行语言编辑和语法改进。作者根据需要审查和修改了输出内容，并对本文的内容负全责。没有使用AI工具进行数据分析和解释。
资助
本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）的科学研究补助金（C类，资助编号22K05824和25K09275）和日本大学对FK的早期职业科学家研究补助金的支持。
致谢
我们感谢日本渔业研究教育机构的Nakayasu博士提供了针对锦鲤IgM（B12）的单克隆抗体，以及Kyushu大学的Somamoto博士对本研究的宝贵建议和有益讨论。我们还要感谢Jordan Hodgkinson博士对英文编辑的帮助。
