一种用于紫红曲（Monascus purpureus）基因组编辑的ATMT-CRISPR/Cas9系统

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：An ATMT-CRISPR/Cas9 system for genome editing in Monascus purpureus

CRISPR/Cas9基因编辑系统通过农杆菌介导转化（ATMT）在紫草茸中实现高效定点整合，避免原质壁分离的复杂性，Cas9蛋白无显著毒性。单基因编辑效率达74%，验证了该系统在功能基因组学和次级代谢调控中的可行性。

　　

摘要

Monascus purpureus是一种在食品和制药行业中具有显著经济价值的丝状真菌，能够产生多种次级代谢产物。尽管CRISPR/Cas9系统已在丝状真菌中得到广泛应用，但主要使用原生质体作为受体，然而由于原生质体制备的固有难度，M. purpureus的基因操作仍然具有挑战性。此外，有报道称Cas9蛋白可能对细胞具有毒性。为了克服这一限制，本研究开发了一种基于Agrobacterium tumefaciens介导的转化（ATMT）的CRISPR/Cas9基因编辑系统。该系统利用M. purpureus的孢子作为受体，并采用同源重组策略将Cas9表达盒稳定地、定点整合到宿主基因组的非编码区域，从而避免了原生质体制备的复杂性以及随机整合事件的不确定性。系统评估表明，Cas9蛋白的稳定表达对M. purpureus的营养生长、生殖发育或特征性色素生物合成没有显著的不良影响。该系统在单基因编辑方面表现出高效率，对于关键色素生物合成途径基因的敲除效率达到了74%。虽然在双基因和三基因编辑时效率有所下降（分别为4.8%和1.7%），但本研究成功验证了该系统在多基因基因组工程中的潜力。所建立的ATMT-CRISPR/Cas9系统证明了M. purpureus基因操作的可行性，为促进该重要工业真菌的功能基因组研究和次级代谢的靶向调控提供了方法论基础。

图形摘要

Monascus purpureus是一种在食品和制药行业中具有显著经济价值的丝状真菌，能够产生多种次级代谢产物。尽管CRISPR/Cas9系统已在丝状真菌中得到广泛应用，但主要使用原生质体作为受体，然而由于原生质体制备的固有难度，M. purpureus的基因操作仍然具有挑战性。此外，有报道称Cas9蛋白可能对细胞具有毒性。为了克服这一限制，本研究开发了一种基于Agrobacterium tumefaciens介导的转化（ATMT）的CRISPR/Cas9基因编辑系统。该系统利用M. purpureus的孢子作为受体，并采用同源重组策略将Cas9表达盒稳定地、定点整合到宿主基因组的非编码区域，从而避免了原生质体制备的复杂性以及随机整合事件的不确定性。系统评估表明，Cas9蛋白的稳定表达对M. purpureus的营养生长、生殖发育或特征性色素生物合成没有显著的不良影响。该系统在单基因编辑方面表现出高效率，对于关键色素生物合成途径基因的敲除效率达到了74%。虽然在双基因和三基因编辑时效率有所下降（分别为4.8%和1.7%），但本研究成功验证了该系统在多基因基因组工程中的潜力。所建立的ATMT-CRISPR/Cas9系统证明了M. purpureus基因操作的可行性，为促进该重要工业真菌的功能基因组研究和次级代谢的靶向调控提供了方法论基础。

图形摘要