《Journal of Agriculture and Food Research》：Rapid and sensitive one-tube detection Bipolaris maydis using RPA-coupled CRISPR/Cas12a assay
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针对玉米小斑病传统检测耗时久、依赖实验室设备的问题，研究人员开发了靶向EF-1α基因的RPA-CRISPR/Cas12a一体化单管检测平台。该方法在37℃恒温下15分钟内完成检测，荧光灵敏度达8拷贝，较qPCR提升10倍，可于接种后2天识别感染叶片，为田间现场诊断提供了高效工具。
玉米是全球种植最广的谷物之一，产量仅次于小麦和水稻，是粮食安全的重要支柱。然而，一种名为玉米小斑病的病害却常年威胁着玉米生产，其致病菌为Bipolaris maydis（玉米小斑病菌）。在流行条件下，这种病害可导致80%至100%的产量损失，对全球粮食安全构成严重威胁。传统的检测方法主要依赖实验室培养和形态学鉴定，过程缓慢且需要专业人员；基于PCR的分子检测虽然准确，但离不开昂贵的温控仪器和专业实验室，难以在田间地头推广。如何在发病早期、在资源有限的农田环境中快速准确地揪出这个“隐形杀手”，一直是植物保护领域的难题。
为了解决这一痛点，来自河南科技学院的研究团队在《Journal of Agriculture and Food Research》上发表了一项创新成果。他们开发了一种基于重组酶聚合酶扩增（RPA）耦合CRISPR/Cas12a的一体化单管检测技术，专门用于快速诊断Bipolaris maydis。这项研究不仅大幅缩短了检测时间，还将灵敏度提升至单拷贝级别，为田间现场检测提供了极具潜力的解决方案。
研究人员在开展研究时，主要采用了以下关键技术方法：首先从不同地区收集Bipolaris maydis菌株并提取DNA，以翻译延伸因子1-α（EF-1α）基因为靶标设计RPA引物和crRNA；随后构建了将RPA扩增体系置于管底、CRISPR/Cas12a检测试剂预置于管盖的空间分离式单管反应平台；在此基础上，系统优化了反应温度、时间、Cas12a酶量及报告探针浓度等参数；最后通过包含多种常见玉米病原菌的样本队列验证了方法的特异性，并利用梯度稀释的基因组DNA评估了荧光与侧向层析试纸条（LFS）两种读出的灵敏度，同时在人工接种的玉米幼苗上进行了早期感染诊断验证。
3.1. RPA Primers Screening
研究人员设计了三对RPA引物，通过琼脂糖凝胶电泳筛选特异性。结果显示，只有引物对BMF3/R3能够特异性扩增Bipolaris maydis的DNA，而对Exserohilum turcicum、Bipolaris sorghicola等其他11种常见玉米相关真菌无交叉反应。基于此特异性扩增产物，研究人员进一步设计了靶向保守区域且紧邻Cas12a必需PAM序列（5′-TTC）的crRNA。
3.2. Optimization of the RPA-Cas12a Reaction Conditions
为了提高检测性能，研究团队对反应条件进行了系统优化。结果表明，RPA扩增的最佳条件为37℃反应5分钟。对于CRISPR/Cas12a检测体系，最佳参数为0.3 μl Cas12a酶、200 nM DNA报告探针，并在37℃下孵育10分钟以获得最大切割效率。这些优化确保了信号输出的稳定性与强度。
3.3. One Tube RPA-Cas12a Detection Platform
研究团队成功构建了一体化单管检测平台。该平台采用空间分离策略：RPA混合液位于管底，CRISPR-Cas12a试剂预置于管盖内侧。首先在37℃下进行5分钟的RPA扩增，随后短暂离心使管盖试剂与扩增产物混合，启动10分钟的CRISPR检测。该体系在田间样本测试中表现出色，荧光信号在10分钟内达到稳定，侧向层析试纸条也显示出清晰的检测线，整个流程仅需15分钟。
3.4. Specificity and sensitivity of RPA-CRISPR/Cas12a assay for detection of B. maydis
特异性测试显示，仅Bipolaris maydis样本产生显著的荧光信号和可见的绿色荧光，侧向层析试纸条上也仅在对应样本中出现了清晰的检测线，证明了该方法极高的特异性。灵敏度评估表明，荧光法检测限低至0.34 pg（约8拷贝），侧向层析试纸条的视觉检测范围为8至80拷贝。相比之下，常规实时荧光定量PCR（qPCR）的检测限为3.4 pg（约80拷贝），证明该方法的灵敏度是qPCR的10倍。
3.5. Early Diagnosis of B. maydis Infection in Maize
在人工接种的玉米幼苗模型中，该方法展现了优异的早期诊断能力。接种后第2天（2 dpi），受感染的玉米叶片即显示出显著的荧光强度升高和清晰的侧向层析试纸条检测线，而阴性对照始终无信号。这表明该技术能够在感染极早期准确识别出病原体。
研究结论与讨论部分指出，选择EF-1α基因而非传统的ITS区域作为靶标，有效解决了近缘物种区分困难的问题，保证了检测的准确性。研究团队创新性地采用的空间分离策略，通过在单管内物理隔离RPA与CRISPR/Cas12a组分，成功避免了扩增产物被过早切割导致的灵敏度下降问题，同时也极大降低了气溶胶污染的风险，比复杂的蔗糖屏障技术更为简便。该平台在37℃恒温下运行，无需精密的热循环仪，配合侧向层析试纸条可实现完全无仪器的可视化判读。其亚皮克级（0.34 pg）的灵敏度优于许多已报道的植物病原RPA-CRISPR检测体系。这项技术不仅为玉米小斑病的早期预警和精准防控提供了强有力的工具，也为其他农作物病害的现场快速诊断平台的开发提供了重要的技术参考和设计思路。
