尽管将信使核糖核酸（mRNA）用作药物或疫苗的研究已经进行了30多年，但基于mRNA的疫苗直到最近才上市[1]。由于严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行，美国食品药品监督管理局（FDA）在2020年紧急批准了辉瑞-BioNTech（Comirnaty）和Moderna（Spikevax）的COVID-19疫苗。除了这些疫苗的安全性和在控制疫情方面的有效性外，它们通过相对低成本的生产过程快速开发出来，也获得了全球公众的认可。事实上，这些疫苗的生产在SARS-CoV-2刺突蛋白序列确定后不到一年内就开始了。与此同时，其他基于mRNA的COVID-19疫苗也获得了FDA和/或欧洲药品管理局（EMA）的批准，例如mNEXSPIKE（Moderna，FDA，2025年）和Kostaive（Seqirus，EMA，2025年）。此外，一种针对老年人（>60岁）的呼吸道合胞病毒（RSV）mRNA疫苗mResvia也最近在欧洲上市（Moderna，EMA，2024年）。去年的另一个里程碑是，一名患有新生儿期氨甲酰磷酸合成酶1缺乏症的婴儿通过所谓的基因编辑得到了成功治疗；在这种情况下，引导RNA标记了需要编辑的基因组位点，而mRNA则编码了编辑蛋白[2]。mRNA药物的迅速兴起促使人们开发出分析工具来评估关键的质量属性（CQAs）。这些CQAs既包括mRNA本身（已知异常物种会损害mRNA的稳定性、翻译效率和免疫原性），也包括其递送载体——脂质纳米颗粒（LNPs）。
从生物学角度来看，mRNA将基因中的序列信息传递给蛋白质翻译机制，即核糖体。这些用于蛋白质生产的序列信息存储在mRNA中的四种不同核糖核苷酸（A、腺苷；C、胞苷；G、鸟苷；U、尿苷）通过磷酸二酯键连接起来（图1）。然而，只有mRNA一级结构中的开放阅读框（ORF）会被翻译，而位于ORF 5’和3’端的非翻译区（UTRs）、5’-帽结构和3’-poly A尾主要起到增强mRNA稳定性和改善翻译起始及效率的作用。这些过程也受到许多通常由酶引入的核糖核苷酸修饰和异构化的影响（以下统称为修饰）。例如，假尿苷（Ψ）和N1-甲基腺苷（m1A）分别对mRNA的稳定性和翻译有积极作用[3]。尽管如此，mRNA修饰还会影响其他生化过程，包括基因表达调控、RNA代谢、相互作用和定位[3,4]。近年来，已鉴定的RNA修饰数量急剧增加，远远超过了脱氧核糖核酸（DNA）的修饰数量，例如，MODOMICS数据库中目前记录了超过300种天然存在的修饰核糖核苷酸[5]。
通过在体外转录过程中添加修饰的核糖核苷酸三磷酸（如N1-甲基假尿苷（m1Ψ）三磷酸[6]），可以改变预防性/治疗性mRNA的结构稳定性、减轻免疫激活并提高其翻译效率。除了这些预期的结构变化外，在合成、配制或储存过程中还可能发生不必要的修饰，这些修饰可能是典型的核酸降解，如氧化、脱氨、磷酸二酯键断裂或碱基丢失[7,8]，也可能是完全未知的。值得注意的是，在mRNA LNP制剂中发现了未知的修饰，例如mRNA与LNP衍生的可电离脂质之间的席夫碱反应形成的加合物[9,10]。因此，除了封端效率和poly A尾长度分布[11]之外，序列保真度也需要作为CQA进行考虑。分析序列保真度包括（i）序列验证、（ii）序列变异的确定以及（iii）序列修饰的检测。前两项可以通过下一代测序（NGS）工具（如Oxford nanopore技术（ONT）或Illumina测序）轻松完成，而对于那些无法通过NGS平台注释或仍未知的修饰，则需要借助质谱（MS）进行追踪。可以通过完整的mRNA水解后对单个核苷酸进行非靶向液相色谱-质谱（LC-MS）分析来检测修饰的核糖核苷酸，但这种加合物组学方法[12]无法提供关于修饰在mRNA序列中的位置信息。为了追踪修饰位点，基于MS的测序（称为RNA图谱分析）目前受到了广泛关注。然而，在实现定位修饰之前，RNA图谱分析必须能够完全覆盖mRNA序列。
McCloskey、Kirpekar和Limbach的研究团队首次开展了基于MS的RNA图谱分析，以确定尤其是核糖体RNA（rRNA）和转运RNA（tRNA）上的修饰位点[13],[14],[15],[16],[17],[18],[19]。由于许多RNA的分子量较大，无法通过MS轻松测定，因此使用单链RNA特异性核糖核酸酶（RNases）如RNase T1（切割位点：G单位的3’末端）、RNase A（C或U的3’末端）和RNase U2（A的3’末端）将RNA消化成较小的寡核苷酸。通常先进行RNA变性处理，然后通过电喷雾离子化（ESI）的LC-MS或基质辅助激光解吸/电离（MALDI）直接将寡核苷酸引入MS进行分析。随后将记录的寡核苷酸质量与计算机模拟的消化产物进行比较。值得注意的是，在6000 Da的质量范围内，任何给定的1-Da区间内不会包含超过两种不同的寡核苷酸序列[14]，这大大方便了寡核苷酸的注释。然而，记录的寡核苷酸质量可能表示在整个RNA序列中多次出现的序列（非唯一寡核苷酸），或者可能与RNA中存在的多个异构序列位点相关。因此，提出了许多改进的RNA图谱分析版本，包括LC-MS优化[11],[20],[21],[22],[23],[24]，以便对长RNA（如mRNA）进行图谱分析。
为了避免非唯一寡核苷酸的问题，可以采用（i）使用RNase T1等部分消化条件[25],[26],[27]生成更长的寡核苷酸长度，或（ii）使用更具选择性的RNase（如RNase 4，切割UG或UA之间的位点[28],[29],[30],[31]）生成重叠的寡核苷酸序列，或者通过使用不同RNase的并行消化[20,32]。除了非唯一寡核苷酸外，RNA图谱分析还需要处理不同异构mRNA位点的分配问题，这主要通过基于MS的气相碎裂（MS/MS）来实现，例如使用碰撞诱导解离（CID）。尽管MS/MS对于寡核苷酸测序已经得到了很好的研究和优化[33],[34],[35]，但在MS/MS过程中仍可能错误地注释异构体，因为寡核苷酸仅由有限的几种单体组成。因此，不同的MS/MS碎裂途径在同一MS/MS谱中或不同寡核苷酸序列的MS/MS谱之间可能会产生异构体和/或相同的产物离子[35]。从这个角度来看，除了MS/MS之外，还需要一种正交的基于MS的寡核苷酸注释方法，以便在处理较大RNA分子（如mRNA）时获得更可靠的注释和更高的序列覆盖率（SC）。
在这里，我们将RNase T1消化得到的短寡核苷酸序列与RNase 4消化得到的长序列结合起来，以提高编码萤火虫荧光素（FLuc mRNA）的ORF的序列覆盖率（SC）。利用自主研发的MSsenger程序，通过基于CID的光谱解析来支持序列分配的寡核苷酸质量，其中基于随机异构序列池的重采样程序计算出各寡核苷酸的显著性。为了进一步优化，该RNA图谱分析平台扩展了一种新的方法，该方法使用自制的RNase A载体对洗脱后的RNase 4衍生寡核苷酸进行柱后消化。这种方法将FLuc mRNA ORF的SC从基于CID的RNA图谱分析的77%提高到了89%。
