一种铜替代方法，用于现代地质和环境样品中叶绿素衍生卟啉的选择性分析

《Journal of Chromatography A》：A copper substitution approach for the selective analysis of chlorophyll-derived porphyrins in modern geological and environmental samples

本研究开发了铜替代预处理方法，用于地质样本中叶绿素及其衍生物的高效转化和选择性分析。该方法通过铜离子置换叶绿素中的镁离子，形成稳定的Cu(II)卟啉，有效解决了传统方法中卟啉类化合物混合检测的问题，并成功应用于湖泊沉积物样本的检测。

　　

杨若晨|夏晓伟|陈俊阳|何晨|张亚禾|吴建勋|史全

中国石油大学重油加工国家重点实验室，北京 102249，中国

摘要

叶绿素的输入为重建古生产力及追踪地质基质中的成岩作用提供了关键信息。然而，由于叶绿素容易发生脱金属化和碳链断裂，导致形成复杂的改性Mg(II)卟啉和卟吩混合物，从而阻碍了精确分析。本文开发了一种铜置换预处理方法，该方法能选择性地将天然叶绿素及其衍生的Mg(II)卟啉和卟吩转化为稳定的Cu(II)卟啉，从而实现对叶绿素衍生物的全面定性和定量分析。该方法使用模型化合物和超高效液相色谱-超高分辨率质谱（UPLC-Orbitrap MS）进行了评估，结果显示使用CuCl₂时叶绿素a的转化率超过95%，使用Cu片时卟吩的转化率为89%；而非目标金属Ni(II)、V(IV)和Fe(III)卟啉未受影响。将该方法应用于湖泊沉积物后，可针对复杂的地质基质特异性分析叶绿素衍生的卟啉。这种策略将叶绿素衍生的卟啉统一为一种可检测的形式，为准确重建地质样品中的初始叶绿素输入和组成提供了选择性方法。

引言

叶绿素（一种Mg(II)卟啉）是保存在地质基质中的重要生物标志物。沉积记录中叶绿素的输入为重建过去的生物地球化学过程和古环境条件提供了关键线索[[1], [2], [3]]。然而，叶绿素本身不稳定，在温和条件下容易失去Mg²⁺并发生碳链断裂[4,5]。这种双重降解途径在天然样品中产生复杂的衍生物混合物，包括Mg(II)卟啉和卟吩。同时捕获叶绿素及其衍生的卟啉（叶绿素衍生卟啉）仍然具有挑战性，这影响了定性和定量分析的准确性，最终限制了古环境重建的可靠性。

传统的叶绿素分析依赖于光谱技术。虽然UV–Vis光谱技术能快速定量分析，并广泛应用于环境样品[6,7]，但它难以解析详细的分子组成。这一点至关重要，因为叶绿素衍生卟啉的分子特征携带了关键的成岩信息[8]。高分辨率质谱（HRMS）的出现彻底改变了卟啉的分子水平表征[[9], [10], [11]]。例如，傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）结合正离子大气压光电离（APPI）技术能够直接检测石油中不同碳数范围的V(IV)卟啉。V(IV)卟啉的双峰碳数分布表明其低分子量和高分子量组分具有不同的来源，为了解其生物来源提供了线索[12]。同样，正离子电喷雾离子化（ESI）FT-ICR MS对海洋页岩的分析能够同时检测多种金属卟啉，包括V(IV)、Ni(II)、Fe(III)和Ga(III)复合物，这些复合物的分布模式可作为重建古沉积环境的宝贵指标[13]。然而，将HRMS应用于复杂地质样品时常常受到基质效应的干扰。这些效应需要结合广泛的样品预处理程序。常见的预处理步骤（如去除元素硫）通常使用还原剂，这可能对卟啉的完整性造成未知风险。另一种常规方法是通过酸脱金属来促进提取并减少基质效应[14]，但这样做会破坏金属卟啉携带的来源信息。这一点尤为重要，因为血红素衍生物（铁血红素，Fe(III)卟啉）是一种常见且稳定的地质卟啉[15,16]，在这样的处理后无法与叶绿素衍生的卟啉（Mg(II)卟啉/卟吩）区分开来。因此，需要一种仅转化叶绿素及其衍生物而不破坏血红素和其他金属卟啉的选择性方法。

几十年来，Cu(II)与卟啉大环之间的强配位作用被食品工业用来保持蔬菜的绿色[17,18]。这种应用基于将不太稳定的Mg(II)叶绿素转化为高度稳定的Cu(II)叶绿素[[19], [20], [21]]。尽管可以通过铜置换将Mg(II)卟啉转化为Cu(II)类似物，但这种转化的效率尚不清楚。此外，目前还不清楚地质基质中常见的其他卟啉是否也会发生转化。

本研究旨在开发并验证一种针对地质样品中叶绿素衍生卟啉的铜置换预处理方法。我们对一系列模型金属卟啉的铜置换可行性和选择性进行了全面研究，并使用超高效液相色谱-超高分辨率质谱（UPLC-Orbitrap MS）分析了反应系统。此外，还通过复杂的湖泊沉积物基质证明了该方法的实用性。

样本和试剂

乙腈（ACN）、超纯水（H₂O）、甲醇（MeOH）、甲酸（FA）、二氯甲烷（DCM）（均为高效液相色谱级）和CuCl₂（98%，分析级）均购自Macklin公司。铜（Cu，纯度≥99.99%）购自上海迪百生物技术有限公司。六种模型化合物包括四苯基卟啉（Ⅲ）（C₄₄H₂₈N₄Fe）、四苯基卟啉镍（II）（C₄₄H₂₈N₄Ni）、八乙基卟啉钒（IV）氧化物（C₃₆H₄₄N₄OV）、八乙基卟啉（C₃₆H₄₆N₄）等。

铜置换对金属卟啉的选择性

这六种模型化合物通过UPLC-Orbitrap MS进行了分离和分析。所有分析物在正离子ESI条件下均实现了高效离子化。铜置换前后六种模型化合物的提取离子色谱图（EICs）见图1。在相同的色谱条件下，保留时间不变性作为识别未发生变化化合物的诊断标准；而铜置换后保留时间的显著变化则表明

结论

本研究建立了一种基于铜置换的方法，用于处理地质样品中叶绿素衍生卟啉的复杂组成。通过选择性地将叶绿素衍生的卟啉转化为稳定的Cu(II)类似物，同时保持稳定的金属卟啉不受影响，该方法为叶绿素衍生物的全面分析提供了统一的框架。该方法表现出高选择性，能够有效转化Mg(II)卟啉和卟吩，同时保持其他金属卟啉的稳定性。

作者贡献

杨若晨：撰写原始稿件、方法学研究、数据可视化及正式分析。夏晓伟：方法学研究。陈俊阳、张亚禾、何晨：方法学研究、数据管理。吴建勋、史全：撰写、审稿与编辑、项目监督。

CRediT作者贡献声明

杨若晨：撰写原始稿件、数据可视化、方法验证、方法研究、概念化。夏晓伟：数据可视化、方法研究、数据分析。陈俊阳：数据可视化、软件应用、数据分析。何晨：方法验证、研究工作。张亚禾：软件应用、方法研究。吴建勋：撰写、审稿与编辑、项目管理和资金申请。史全：撰写、审稿与编辑、方法验证、资源协调、项目管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的利益冲突。

资助信息

本研究得到了国家自然科学基金（编号：42403031）的支持。