《FEBS Open Bio》：Development of human monoclonal antibodies against TARM1 by yeast display
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针对人源TARM1功能研究工具匮乏的现状，本研究利用酵母展示平台结合人源scFv文库，成功筛选出两株高亲和力抗人TARM1单克隆抗体(mAb)。该抗体可特异性结合重组及细胞表面TARM1，并在Jurkat NFAT-GFP报告细胞中诱导激活信号，证实其激动剂活性。这一成果填补了人源TARM1抗体空白，为解析TARM1介导的免疫调节机制及开发炎症与肿瘤治疗策略提供了重要工具。
在人体的免疫系统中，有一群被称为“白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)”的蛋白质家族，它们就像免疫反应的“刹车”和“油门”，调控着先天与适应性免疫的平衡。其中，T细胞相互作用、髓系细胞激活受体1(TARM1)是一个备受关注的“油门”——它主要在中性粒细胞、单核细胞等髓系细胞上表达，通过与携带免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的Fc受体γ链结合，传递激活信号，促进促炎细胞因子的分泌。近年来的研究逐渐揭开了TARM1的神秘面纱：它不仅参与类风湿关节炎的发生发展，增强树突状细胞活化并推动T细胞应答；还在结核分枝杆菌感染、小鼠结肠炎的巨噬细胞M1极化中扮演重要角色；甚至在急性肾损伤中，巨噬细胞的自噬会通过降解TARM1来保护肾脏免受炎症损伤。这些发现都指向一个结论：TARM1是调节免疫反应极具潜力的治疗靶点。然而，尽管其生物学重要性日益凸显，针对人源TARM1的研究工具却十分有限——此前仅报道过针对小鼠TARM1的单克隆抗体，完全的人源或人源化TARM1特异性抗体仍是空白。这不仅阻碍了对其功能的深入探索，也限制了其临床转化潜力。如何打破这一瓶颈？一项发表于《FEBS Open Bio》的最新研究给出了答案。
为了解决这一问题，研究人员利用酵母展示平台结合人源单链可变片段(scFv)文库，开展了针对人源TARM1的单克隆抗体开发研究。他们首先构建了表达人源TARM1胞外区与IgG1 Fc融合蛋白(TARM1-Fc)的载体，并通过四轮筛选（磁激活细胞分选MACS与荧光激活细胞分选FACS结合）从人源scFv酵母展示库中富集TARM1结合克隆。随后将筛选得到的scFv转化为全长IgG1抗体，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、生物层干涉技术(BLI)、流式细胞术等方法评估其结合特性，并利用Jurkat NFAT-GFP报告细胞系统检测其激动剂活性。此外，研究人员还通过构建稳定表达Flag标签TARM1的293FT细胞系，验证了抗体对细胞表面天然构象TARM1的识别能力，并尝试将其应用于蛋白质印迹(Western blot)、免疫沉淀和免疫细胞化学等生化检测。
研究结果显示，经过四轮筛选后，酵母群体中scFv阳性且TARM1-Fc结合的克隆比例显著增加。对13个随机挑选的克隆进行测序分析，发现其中8个为同一序列（命名为CITA-001，占61.5%），3个为另一独特序列（CITA-006，占23.1%），其余2个各为一个独立序列。流式细胞术分析证实，CITA-001和CITA-006均能特异性结合TARM1-Fc，而不结合对照Fc蛋白。将scFv序列转化为全长IgG1抗体后，ELISA实验显示两种抗体均能以剂量依赖方式结合TARM1-Fc。进一步通过BLI测定结合亲和力，CITA-001的平衡解离常数(KD)为3.9±0.2 nM，CITA-006的KD为1.6±0.2 nM，表明两者均具有高亲和力。在细胞水平，流式细胞术检测发现，CITA-001能显著结合稳定表达Flag-TARM1的293FT细胞表面的TARM1，而CITA-006虽结合信号较弱但可重复检测到，均优于同型对照抗体。然而，这两种抗体在Western blot、免疫沉淀和免疫细胞化学实验中均未能检测到TARM1蛋白，提示其可能仅识别天然构象的TARM1，无法结合变性或固定后的蛋白。功能验证方面，研究人员构建了表达Flag-TARM1-CD28-4-1BB-CD3ζ嵌合受体的Jurkat NFAT-GFP报告细胞系，刺激该嵌合受体可激活NFAT依赖的转录并诱导GFP表达。实验发现，CITA-001和CITA-006均能在该系统中诱导GFP表达，而同型对照IgG1无此效应，证实其具有激动剂活性。但在原代人单核细胞来源的树突状细胞(moDC)刺激实验中，由于对照人IgG1本身可通过Fc受体(FcR)介导激活效应，未能明确区分抗体的特异性激动作用。
该研究成功开发了两种完全人源的抗TARM1单克隆抗体CITA-001和CITA-006，它们不仅能特异性结合重组及细胞表面天然构象的TARM1，还具有显著的激动剂活性。这一成果填补了人源TARM1抗体工具的空白，为深入研究TARM1在免疫调节中的作用机制提供了关键试剂。同时，作为完全人源抗体，其避免了传统鼠源抗体需要人源化改造的步骤，更具临床转化潜力。从治疗角度看，TARM1作为髓系细胞上的激活受体，其激动剂有望重编程肿瘤相关髓系细胞向促炎、抗肿瘤表型转化，为免疫检查点抑制剂无效的患者提供新的联合治疗策略。尽管目前抗体在常规生化检测和原代细胞功能验证中存在一定局限性，但通过Fc工程改造或实验体系优化，未来仍有望拓展其应用场景。此外，研究还指出抗体可能仅与人源TARM1交叉反应，这为后续利用小鼠模型开展体内研究提供了重要参考。总体而言，这项研究不仅为基础免疫学提供了有力工具，也为炎症性疾病和癌症的免疫治疗开辟了新方向。
