《Methods》：Renovating the Barnes maze for mouse models of dementia with STARR FIELD: A 4-day protocol for learning rate, retention, and cognitive flexibility
编辑推荐：
本研究改进了Barnes迷宫实验设计，采用3D打印转移箱和家笼连接装置，减少嗅觉干扰对学习率评估的影响，并开发了STARR迷宫测试行为灵活性。实验验证了改进方案在阿尔茨海默病、脑干功能障碍及衰老模型中的适用性，明确了不同结果指标的应用场景，为神经退行性疾病研究提供标准化评估方法。
Aimee Bertolli | Oday Halhouli | Matthew A. Weber | Yiming Liu-Martínez | Linder H. Wendt | Brianna Blaine | Ramasamy Thangavel | Sura Smadi | Preston J. Pellatz | Danlin Liu | Kaisa N. Bornhoft | Kalpana Gupta | Riley Dean | Margaret M. Tish | Gemma Kerr | Shane A. Heiney | Eric B. Emmons | Qiang Zhang | Serena B. Gumusoglu | Nandakumar S. Narayanan | Georgina M. Aldridge
美国爱荷华大学卡弗医学院神经学系
摘要
基于陆地的空间迷宫是一种低压力方法，用于评估痴呆症啮齿动物模型的学习能力。通过利用啮齿动物天生的探索行为和隐藏行为，Barnes迷宫所需的试验次数较少，从而可以检测早期学习速度和记忆保持能力，以及执行功能和动机特征，这些特征可能是非遗忘性痴呆症的特点。然而，不希望出现的气味线索可能会干扰对学习过程的解释。我们设计并测试了Barnes FIELD协议（“寻找隐形出口以定位住所”），以提高实验的可重复性，便于评估学习过程，并减少实验者的影响。该协议使用3D打印的穿梭工具和对接隧道，使小鼠能够从迷宫返回到饲养笼中。我们证明了这些穿梭工具能够减少不希望出现的气味线索的影响。我们在多种认知障碍和衰老模型中验证了该协议的可行性，并开发了一个额外的阶段——STARR（空间训练与快速逆转）迷宫，以更好地测试行为灵活性。通过分析常用的结果指标，我们确定了解释数据时需要考虑的重要因素。这些发现有助于评估多种认知变化模型，包括阿尔茨海默病小鼠模型中的缺陷和脑干功能障碍模型中的行为灵活性。本文提供了构建、执行和分析这种强大空间迷宫的全面说明，扩展了可识别和筛选的行为和动机结果的范围。我们的发现将有助于解释传统实验结果，提高实验的严谨性和可重复性，并提供一种更新的方法来检测小鼠的认知变化。
引言
神经退行性痴呆症是一种毁灭性的、无法治愈的疾病，影响着全球5500万人，导致严重的残疾和死亡[1]。小鼠模型被用于研究发病机制和测试新疗法；它们具有相似的皮质结构、许多保守的脑干投射以及丰富的遗传工具[2]、[3]、[4]、[5]。啮齿动物的行为任务被广泛用于评估阿尔茨海默病（AD）模型中的短期记忆缺陷。然而，很少有研究关注认知的非记忆方面，如执行功能障碍，而这些功能是其他形式痴呆症（包括额叶变异型AD、路易体痴呆、额颞叶痴呆、血管性痴呆和正常压力脑积水）的常见特征[6]、[7]、[8]、[9]。
使用基于本能动机的任务（如对新奇事物的兴趣和记忆逃避位置的能力，例如Morris水迷宫）不需要大量训练[10]、[11]、[12]。在这些基于本能的任务中，短期记忆保持通常被用作关键的结果指标[13]、[14]。然而，自然主义任务还提供了测试主动获取能力和动机的可能性，而不仅仅是记忆保持能力。这包括受执行功能（如学习速度、工作记忆、行为灵活性、排序、计划）和动机（如坚持性、毅力、探索、焦虑）影响的结果。动机和执行功能障碍都是神经退行性疾病的关键特征[15]、[16]。
探究执行功能的研究通常需要长时间的训练方案、昂贵的操作室或强烈的动机刺激[17]。为了更好地检测更广泛的行为表型，我们选择优化了Barnes迷宫，这是一种由Carol Barnes最初为大鼠开发的广泛使用的空间学习和记忆任务[18]。这种基于陆地的迷宫每年被数百篇研究文章使用。它的具体优点包括：1）类似于啮齿动物的自然行为（探索和记住隐藏位置）；2）不需要食物或水的激励；3）相对低压力；4）可以适应有运动缺陷的小鼠（无需强制游泳）；5）易于获取且建造成本相对较低[17]、[19]、[20]、[21]。
在这个任务中，小鼠被放置在一个大型、明亮、开放的平台上，平台边缘有孔（图1）。其中一个孔通向一个黑暗的逃生箱。小鼠天生就有寻找逃生路线并记住位置的愿望[12]。研究人员使用各种结果指标（如距离、潜伏期或学习过程中探索的孔的数量）来衡量学习速度。接下来进行一个单独的探测试验。在探测过程中，逃生箱被移除。探索目标位置所花费的时间比例被用作对该位置记忆的证据。
在我们早期使用Barnes迷宫时，我们注意到意外的气味线索可能会干扰学习过程并无意中影响结果的解释。我们发现，如果将小鼠的饲养笼连接到逃生箱上，一些小鼠即使每次试验目标位置都随机移动，也能反复找到目标孔。大多数商业设备在所有学习试验中都使用同一个逃生箱，这也是气味线索的潜在来源。尽管大多数Barnes协议在每次试验后都会清洁逃生箱，但其单独存在的状态本身就是一个明显的气味干扰因素。这种干扰导致许多研究人员只分析探测试验，因为在这个试验中逃生箱被移除了。
将分析限制在探测试验中，会忽略评估学习速度、搜索策略、探索效率以及对目标位置变化反应的必要信息，从而无法评估行为灵活性。因此，我们设计了一个廉价的3D打印逃生箱（“穿梭工具”），可以部署在大多数标准的Barnes迷宫上，使研究人员能够拥有多个逃生箱副本，以减少迷宫内气味线索的干扰。改进后的协议Barnes FIELD（“寻找隐形出口以定位住所”）创建了“隐形”的出口，并设计了连接到饲养笼的穿梭工具（在找到出口后），提供自然主义的强化效果并减少实验者的干扰。
我们通过比较未清洗的穿梭工具和干净的3D打印穿梭工具，直接测试了Barnes FIELD协议的好处。我们证明小鼠能够根据探测试验的结果检测到气味线索。这项研究的设计还使我们能够测试最近的证据，即早期学习试验中潜伏期和距离的显著改善是由非空间学习驱动的[22]、[23]、[24]。在这种情况下，非空间学习可能包括与空间位置同时获得的元学习、动机、程序学习和习惯化方面的改进。因此，我们进一步调整了Barnes空间迷宫，在学习过程中加入间歇性的探测试验，以分离空间记忆的获取和保持。最后，我们开发了一个额外的阶段——STARR迷宫协议（空间训练与快速逆转），可以在任何Barnes协议（包括我们的Barnes FIELD协议）的末尾使用，以测试行为灵活性。
这些发现使我们能够在爱荷华大学神经退行性疾病实验室当前使用的衰老和痴呆症模型中测试我们的Barnes FIELD和STARR迷宫协议。这些模型包括：1）β-淀粉样蛋白斑块形成的模型5xFAD[25]；2）通过脑池注射高岭土诱导的正常压力脑积水模型[26]；3）比较未生育和产后一年大的雌性小鼠的差异性衰老模型[27]；以及4）模仿路易体疾病中看到的去甲肾上腺素功能障碍的蓝斑损伤模型（DSP-4毒素）。
我们评估了在这些模型中使用Barnes FIELD和STARR迷宫协议的情况，强调了当所有试验都能更可靠地解释时可以评估的任务方面。
设备
对于已停产的物品，请参阅补充方法部分以获取物品的照片和潜在替代品。本研究中所有打印的物品都是使用Prusa i3 MK3S+ 3D打印机和聚乳酸（PLA）材料打印的，未使用支撑结构（图1）。根据早期测试，灰色PLA（AmazonBasics，颜色：浅灰色，1.75毫米）被用于制作穿梭工具箱；因为白色会导致过多的光线进入穿梭工具箱，而较深的颜色会干扰跟踪软件，所以使用了白色PLA（AmazonBasics，颜色：白色，1.75毫米）。
结果
在基于陆地的迷宫中估计学习速度时存在两个障碍：首先，小鼠可能会在学习过程中利用嗅觉或迷宫内的视觉线索来定位目标逃生箱。其次，关于哪些结果指标（如潜伏期、距离等）对学习速度的缺陷最敏感和特异，文献中的观点并不一致。
为了克服这些障碍，我们设计了可以重复打印的新逃生箱。
讨论
我们修改了一个经典的、广泛使用的基于陆地的空间学习和记忆任务，通过使用3D打印的穿梭工具和任何实验室都可以制作的饲养笼附件，更好地识别学习速度并提高实验的可重复性。重要的是，我们比较不同结果指标的发现有助于更好地解释Barnes迷宫，即使这些协议与这里推荐的协议有所不同。
为了测试我们3D打印穿梭工具的实用性和必要性，我们测试了……
局限性
手稿中讨论了各种限制和存在的空白。需要注意的是，这些协议是在多年过程中根据不同实验室的需求由不同的研究人员进行调整和修改的。因此，在比较不同认知模型时必须谨慎，特别是由于模型之间没有交叉设计，且对照组之间存在显著差异。同样，我们也无法严格测试所有……
资助
这项工作得到了NIH RO1s项目（NINDS NS129711、NINDS NS134833）、Roy J. Carver慈善信托基金的SMASH痴呆症研究计划、爱荷华大学医学科学家培训计划、GMA的STead家族奖学金以及美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心的资助（奖励编号UM1TR004403）。此外，还得到了脑积水协会2019创新奖对JCG的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
