克罗塞汀是一种生物活性代谢物，最初发现于藏红花（Crocus sativus L.）中，它是通过克罗辛的水解产生的（结构见图1）。克罗塞汀是一种多不饱和共轭酸，分子式为C??H??O?，分子量为328.4 g·mol?1，具有四个甲基取代基和七个共轭双键，存在cis和trans两种异构形式。越来越多的证据表明，克罗塞汀具有广泛的保护和治疗作用，包括心脏保护、肝脏保护、神经保护、抗抑郁、抗病毒、抗癌、抗糖尿病以及增强记忆等效果。其作用机制涉及促进氧气运输和扩散、抑制促炎介质、保护细胞免受活性氧（ROS）损伤以及诱导癌细胞凋亡[1]。药代动力学和药理学研究证实，克罗塞汀是克罗辛治疗效果的主要负责代谢物[2]。
克罗塞汀在Crocus sativus L.的柱头和Gardenia jasminoides J. Ellis的果实中以微量存在（干物质基计<0.05%），通常通过克罗辛的水解获得。商业藏红花中克罗辛的总含量范围为2.8–25.6%，其中摩洛哥藏红花含量为29.01±5.6%，西班牙藏红花含量为11.57–17.67%[4,5]。相比之下，G. jasminoides果实中的克罗辛含量较低，分别为1.5–3.5%[6,7]。然而，藏红花是一种极其昂贵的香料（约1000美元/千克），因为其产量很低，大约需要80,000朵C. sativus花朵才能生产1磅藏红花[8]。相比之下，G. jasminoides是一种更为经济的替代品（约1美元/千克），在中国江西、河南、湖北、福建和四川等省份广泛种植，产量高且成本低[9]。
传统的克罗塞汀制备方法首先从C. sativus L.或G. jasminoides J. Ellis中提取克罗辛，然后进行碱性或酶促水解。Reddy等人开发了一种从藏红花原料制备克罗塞汀的方法，包括原料提取、提取物碱性水解、中和以及最终用有机溶剂提取得到粗克罗塞汀[8]。Lautenschl?ger等人使用两种不同的糖苷酶（RoehmEnzym?和Rohament CL?）催化藏红花来源的克罗辛-1的脱糖反应，再通过中压液相色谱纯化得到克罗塞汀[10]。Qian等人使用Amberlite D140树脂从栀子果实中提取黄色色素，随后进行碱性水解和酸化处理，并最终用二甲酰胺结晶得到克罗塞汀[11]。Zhang等人选用SPE-007A酶催化栀子果实的酶解反应，通过碱性水解和酸化处理后，再结合硅胶柱色谱和重结晶纯化目标产物[12]。这些方法耗时较长，且多数步骤复杂，需要使用大量对环境不友好的酸、碱和有机溶剂。
自2003年首次发表关于深共晶溶剂（DESs）的文章以来[13]，这类新型绿色溶剂因其独特的物理化学性质而受到越来越多的关注，包括易于合成、低成本、环境友好、低挥发性、高溶解能力、优异的生物降解性和结构设计灵活性[14]。深共晶溶剂由氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）组成；当组成成分均为初级代谢物时，这类溶剂被称为天然深共晶溶剂（NADES）[15]。NADES内部的独特分子间相互作用和结构安排赋予其卓越的溶解和稳定能力[16]。与传统有机溶剂不同，NADES的溶解行为受多种分子力的共同作用影响，包括氢键、范德华力、静电作用、π–π堆积、偶极-偶极相互作用以及溶剂与目标分析物之间的亲水-疏水效应。迄今为止，NADES已被广泛用作天然产物提取和分离的环保替代品[17,18]。此外，多项研究还展示了NADES在生物质转化成多种化学品方面的应用潜力[19]。例如，基于脂肪酸的疏水性DESs已被用于促进Z-异构体的形成（总Z-异构体产率约70%）和番茄红素的降解[20]。
我们之前的研究表明，NADES可作为多功能溶剂，既能从原料中提取克罗辛，又能同时催化糖苷水解生成克罗塞汀。我们开发了一系列由苄基氯化物和草酸组成的DES，并评估了它们的提取和转化效率[21]。基于此基础，我们选择了更具生物相容性的组合——氯化胆碱和草酸[22]进行进一步研究。氯化胆碱（ChCl）是合成NADES的典型HBA，而草酸（OA）是真菌、细菌、植物和动物中普遍存在的有机酸之一[23]，在NADES制备中作为有效的HBD。ChCl-OA NADES已被用于花青素[24]、多酚[26]、芝麻蛋白[27]和鳕鱼皮胶原蛋白[28]的提取。然而，目前尚无关于其在克罗辛或克罗塞汀研究中的应用报道。
通过碱性或酶促水解获得的粗克罗塞汀纯度较低，因此需要进一步纯化。如前所述，这类纯化通常依赖于多步骤色谱分离[10]和/或重结晶[11]。逆流色谱（CCC）是一种独特的液-液分离技术，无需固体支撑物来固定固定相，能有效避免样品吸附、失活或变性，特别适合分离生物活性成分。其显著优势包括高样品负荷量、优异的回收率、高效的分离效果、操作简便性和低成本。已有报道表明，通过碱性水解后使用CCC可以分离出克罗塞汀，但仅能获得少量trans-和cis-克罗辛混合物（分离时间近8小时[29]。Chyau等人还使用离心分配色谱（CPC）从经过16小时酶促转化后的粗产物中纯化克罗塞汀，并进行了HPD-100微孔树脂预纯化[30]。这两种分离方法操作繁琐，不适合大规模生产。
在本研究中，我们结合NADES催化的克罗辛转化技术和基于HPCCC的纯化技术，开发了一种高效的高纯度克罗塞汀制备方法。具体而言，优化了氯化胆碱-草酸NADES系统的反应条件，从而从Gardenia jasminoides Ellis的果实提取物中获得了高产量的粗克罗塞汀。后续通过n-丁醇/碳酸钠水溶液进行HPCCC纯化，该过程高效且易于放大。这种集成方法实现了高纯度trans-和cis-克罗塞汀异构体的快速制备。通过质谱（MS）和核磁共振（NMR）光谱验证了这些异构体的化学结构，并通过分子动力学模拟阐明了NADES系统催化克罗辛转化的分子机制。
