《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：ATR-FTIR analysis of temperature-dependent changes in extracellular vesicles and associated released components
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外泌体ATR-FTIR光谱分析显示吹干可消除水分干扰并清晰识别EV特征信号，特定波段（1800-650 cm?1）可有效区分上皮细胞EVs与肝细胞癌和胚胎肾细胞EVs。研究发现冻干处理能保持热释放化合物完整性，EVs富含磷脂和蛋白质，滤液则显示降解成分。
Kar-Yan Su | Oxana Klementieva | Wai-Leng Lee | Siong Fong Sim | Laura-Madalina Lixandru | Carmenza Spadafora | Mihai Brebu | Elena Stoleru | Mohammad Mehedi Hasan | Pascale V. Guillot | Radu Ionescu
瑞典隆德大学实验医学科学系，22184隆德
摘要
近年来，振动光谱技术的进步证明了其作为研究细胞外囊泡（EVs）的可靠、快速且操作独立的工具。为了进一步探索振动光谱在EV特征分析中的潜力，本研究利用衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱技术分析了从不同细胞系中分离出的EVs。从-80°C储存后在4°C解冻的样品中获得的EVs光谱存在噪声，并受到水分的影响，但通过吹干预处理步骤可以有效去除水分及其对光谱的影响，从而清晰地识别出EVs的特异性信号。通过对ATR-FTIR光谱中特定波段（1800–650 cm?1）的分析，能够明确区分上皮细胞（EPI）EVs与肝细胞癌细胞（HEP-G2）EVs以及胚胎肾细胞（HEK293）EVs。我们在将EVs从PBS中分离出来并经过无热吹干处理后，检测到了相应的信号，并进一步观察了它们在热处理后的变化。在吹干条件下，未能检测到60°C破坏后EVs释放的化合物的特征信号；然而，当滤液经过冻干处理后，这些信号得以保留，这表明冻干对于保持化合物的完整性至关重要。对EVs及其释放的化合物进行比较ATR-FTIR分析后发现，EVs富含磷脂和蛋白质，而滤液则包含更多均质化的分子。
引言
细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有细胞类型释放的纳米至微米级的脂质双层颗粒。它们通过运输蛋白质、核酸、脂质和代谢物，在生物系统中调节细胞间通讯，并影响广泛的生理和病理过程[17]、[23]。EVs调节受体细胞行为的能力使其成为早期疾病检测的有希望的生物标志物，并成为精准医学中的新兴工具（Simon等人，2018；Yá?ez-Mó等人，2015；[7]）。尽管如此，EV研究仍面临诸多分析挑战。EVs表现出明显的分子和结构异质性，即使是微小的分离流程差异也可能产生不同的囊泡群体，最终影响数据的可比性和解释性。这些限制凸显了开发稳健、可重复的表征策略的迫切需求，这些策略能够评估EV的纯度、物理属性和生化组成[19]。
振动光谱技术最近作为解决这些挑战的有效方法而受到关注。拉曼光谱和衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱提供了快速、操作独立的分析手段，且仅需少量样品[24]。这些方法能够确定光谱中的脂质与蛋白质（Li/Pr）比例——这一比例是评估EV纯度的公认指标，并能从小至2 μL的干燥膜片中提供定性和定量的分子特征信息[12]。通过探测生物分子的内在振动特征，光谱方法提供了综合的分子信息，在某些情况下甚至优于传统的生化检测方法。
在各种光谱技术中，傅里叶变换红外（FTIR）在处理EV异质性方面具有特别的优势。结合计算分析，FTIR能够实现高分辨率的分子分析和模式识别[14]、[21]、[25]。在我们之前的研究中，我们通过分析前列腺癌患者的尿液中的EVs，展示了ATR-FTIR的诊断潜力。在53个样本中，ATR-FTIR揭示了与疾病进展相关的显著光谱变化，其性能优于单独使用前列腺特异性抗原（PSA）检测（AUC = 0.7 vs 0.437）[22]。这些发现强调了FTIR辅助EV分析作为非侵入性方法在改进前列腺癌筛查方面的可行性。
尽管取得了这些进展，但FTIR在EV研究中的应用仍有提升空间。一个关键挑战是样品制备，因为EVs结构脆弱，在高温、不合适的缓冲液或反复的冻融循环下容易发生膜结构改变[3]。这些扰动可能影响光谱测量的准确性。因此，需要优化工作流程，以确保EV的结构及其相关的分子特征得到准确保留。
在这项概念验证研究中，我们系统地比较了多种用于ATR-FTIR分析的EV样品制备策略，考察了EV的特性以及与EV生物化学修饰和释放到溶液中的化合物相关的温度依赖性光谱变化。通过评估不同条件下的方法性能，我们旨在扩展基于光谱的方法的分析效用，并推动其在更广泛的EV特征分析中的应用。
EV样本
如先前报道（R. Capuano等人，《Analytica Chimica Acta》已投稿），EVs是从人类上皮细胞（EPI）、人类肝细胞癌细胞（HEP-G2）和人类胚胎肾细胞（HEK293）中分离得到的。EVs悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，浓度统一为1 × 1011个颗粒/mL。这些囊泡的直径均小于300 nm，大多数在70至165 nm之间。通过检测特定成分确认了EV的身份...
溶液中EVs的分析
从HEK293细胞中分离出的EVs在4°C解冻后进行初始ATR-FTIR分析（如2.3.1节所述），与PBS的背景光谱相比，未发现明显的光谱特征。在3300 cm
?1和1630 cm
?1处观察到主要的水分吸收带（图1a–b），这表明去除水分作为预处理步骤对于揭示潜在的EV特异性信号是必要的。类似的以水带为主的光谱模式也在其他FTIR分析中有所报道...
结论
本研究使用ATR-FTIR光谱技术系统地研究了从EPI、HEK293和HEP-G2细胞系中分离出的EVs，重点关注完整的EVs以及热破坏后释放的化合物。60°C的热处理导致EVs结构发生变化，表现为关键振动带强度的改变，表明囊泡膜被破坏且生物分子被释放。比较EV组分和滤液后发现，EVs富含...
人工智能使用声明
在撰写本手稿的过程中，使用了ChatGPT（OpenAI）进行语言编辑和润色。该工具仅用于提高文章的清晰度、语法和可读性。作者仔细审查并编辑了所有输出内容，并对发表文章的内容负全责。
作者贡献
概念构思：Radu Ionescu、Wai-Leng Lee、Siong Fong Sim；数据管理：Kar-Yan Su、Wai-Leng Lee、Siong Fong Sim、Mohammad Mehedi Hasan、Pascale V. Guillot；形式分析：Siong Fong Sim、Wai-Leng Lee、Radu Ionescu、Kar-Yan Su；资金获取：Radu Ionescu、Oxana Klementieva、Carmenza Spadafora、Mihai Brebu、Elena Stoleru；研究实施：Radu Ionescu、Wai-Leng Lee、Siong Fong Sim、Kar-Yan Su；方法设计：Kar-Yan Su、Wai-Leng Lee、Siong Fong Sim、Mohammad Mehedi Hasan、Pascale V.
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了欧盟“地平线欧洲”研究与创新计划（Marie Sk?odowska-Curie行动——人员交流项目，授权协议号101086360 – VOLATEVS）的支持。该资助方未参与研究设计、数据收集与分析、报告撰写或文章发表决策。
