亚细胞毛细血管采样结合激光消融-电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）技术，能够实现对放射性药物模型中铊的靶向分析

《Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy》：Subcellular capillary sampling coupled to laser ablation – Inductively coupled plasma – Mass spectrometry (LA-ICP-MS) allows targeted analysis of thallium in a radiopharmaceutical model

本研究首次将毛细管采样与激光诱导等离子体质谱（LA-ICP-MS）结合，用于检测活细胞及其亚细胞腔室中的痕量金属。通过优化沉积基底、内标和转移协议，实现了亚细胞分辨率（≤5μm）和灵敏度提升。在PANC-1癌细胞中成功检测到铊（代表放射性同位素铊-201），为靶向放射治疗和细胞金属生物学研究提供了新方法。

　　

克莱尔·戴维森（Claire Davison）| 阿比盖尔·库克（Abigail Cook）| 凯尔·桑德斯（Kyle Saunders）| 艾米丽·A·弗雷泽（Emily A. Fraser）| 菲利普·J·布洛尔（Philip J. Blower）| 卡塔日娜·沃尔夫迈尔（Katarzyna Wulfmeier）| 梅兰妮·贝利（Melanie Bailey）| 丹尼·J.V·贝斯特（Dany J.V. Beste）| 莫妮卡·费利佩-索特洛（Mónica Felipe-Sotelo）

英国萨里大学工程与物理科学学院化学与化学工程系，吉尔福德

摘要

背景

检测亚细胞区室中的微量元素对于理解金属的生物功能以及优化药物输送治疗（包括用于癌症治疗的放射性核素）至关重要。激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）对金属具有极高的灵敏度，但通常仅适用于化学固定的样本。此外，当前LA-ICP-MS系统所能达到的空间分辨率（≤1–5 μm）不足以分辨亚细胞结构。本研究通过将毛细管采样技术与LA-ICP-MS相结合，解决了在活细胞及亚细胞区室中检测金属的难题。

结果

我们提出了一种新的工作流程，通过将毛细管采样与激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）相结合，实现了在活细胞及亚细胞区室中检测金属的目标。该方法包括在共聚焦显微镜下将单个细胞或亚细胞内容物收集到采样毛细管中，然后将其沉积到平坦表面上进行LA-ICP-MS分析。通过使用标准样品和共聚焦显微镜优化了沉积基底（硅片）、内标（铋）、分析物转移及分析流程，以最大限度地提高精确度和灵敏度。随后将该方法应用于培养了氯化铊的PANC-1癌细胞，作为治疗性放射性核素铊-201的模型。在细胞培养基及磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后，均在细胞和富集线粒体的样本中检测到了铊，而对照组则未检测到铊，从而证实了亚细胞金属检测的成功。

意义

该方法能够精确测量活细胞及亚细胞区室中的微量元素，克服了现有金属成像技术的关键限制。通过首次将毛细管采样技术与LA-ICP-MS结合，为研究外源性元素或基于金属的药物治疗在亚细胞水平上的动力学和定位提供了一个强大的平台，对推进靶向放射性核素治疗和细胞金属生物学研究具有巨大潜力。

引言

激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）是一种高灵敏度的元素分析技术，为研究金属的生物功能和优化药物输送治疗提供了有力工具。如先前研究所示，LA-ICP-MS具备进行细胞和亚细胞分析所需的高灵敏度[1]、[2]、[3]。然而，商用LA-ICP-MS激光器所能达到的深度和空间分辨率（≤1–5 μm）限制了亚细胞研究及三维信息的获取[4]。此外，分析前通常需要对细胞培养物进行化学固定或石蜡包埋等样本处理[5]，这阻碍了该技术对活细胞数据的获取。另一种用于单细胞分析的元素分析方法是单细胞ICP-MS（SC-ICP-MS），它可以实现对悬浮单个细胞中金属的高通量定量[5]。尽管SC-ICP-MS具有出色的灵敏度和通量，但它无法保留空间信息，也无法分辨亚细胞结构。因此，能够同时保持空间或亚细胞分辨率并实现定量元素检测的方法仍然非常必要。因此，将LA-ICP-MS与能够在活细胞自然状态下收集和/或操作细胞的替代样本引入方法相结合显得尤为重要。 毛细管采样技术可用于在显微镜观察下从细胞培养物中提取单个活细胞。将毛细管采样技术[6]、[7]整合到LA-ICP-MS分析工作流程中，有望解决上述问题，从而实现对活细胞及亚细胞成分中外源性金属的分析。此前已有研究将毛细管采样技术与有机质谱分析（包括脂质组学[7]、[8]、[9]、代谢组学[8]、[9]以及药物吸收测量[11]）相结合。毛细管采样技术还可以进一步应用于提取亚细胞成分。例如，Esaki等人[12]将HepG2细胞中的线粒体提取到纳米喷雾尖端，并通过主成分分析（PCA）清晰区分了线粒体、细胞质和电离溶剂；Actis等人[13]使用纳米吸管从人类成纤维细胞中提取少量线粒体并对其基因组进行测序；Phelps等人[14]和Yahata等人[15]将毛细管采样技术应用于亚细胞脂滴的质谱分析；Zhang等人[16]则通过毛细管采样提取细胞核和细胞质，随后通过电喷雾离子化（ESI）质谱结合离子迁移率分离（IMS）进行肽特性分析。这些例子展示了毛细管采样技术在分子表征前提取多种亚细胞成分的潜力。 将毛细管采样技术与元素质谱技术相结合的研究尚未充分开展。主要障碍在于需要将细胞材料从采样毛细管转移到质谱仪中：有机质谱常用的溶剂组成和体积与元素分析不兼容。即使在有机质谱领域，目前也缺乏将细胞材料从采样毛细管自动转移到离子源的解决方案。因此，毛细管采样技术与下游质谱工作流程（尤其是在元素检测方面）的结合仍然存在较大差距。本工作系统评估并优化了多种溶剂、基底、洗脱方法和内标，以解决这一问题。 靶向放射性核素治疗（TRT）是一种高精度的癌症治疗方法，通过系统地向肿瘤细胞或其微环境释放辐射，导致不可逆的DNA损伤、细胞凋亡和肿瘤缩小[17]、[18]、[19]。TRT作为癌症治疗方法具有优势（如高度靶向性[17]、治疗周期短、毒性和副作用低[20]、[21]），但实现理想的治疗效果依赖于准确的剂量估算，而这具有挑战性。特别是对于梅特纳-奥格电子（MAE）发射体而言，其在组织中的射程较短（≤500 nm）[22]、[23]，而α粒子（50–100 μm）[24]或β粒子（约1 cm）[25]的射程较长。由于MAE发射体的射程小于哺乳动物细胞的典型尺寸，因此需要精确了解其在细胞和亚细胞中的分布[26]、[27]。 实验上，体外放射性通过亚细胞分级[28]、[29]、荧光染料[30]和微放射自显影[26]、[31]进行追踪。然而，这些技术的局限性包括平均测量结果[26]、[29]、缺乏定量数据[26]、[32]、样本处理对TRT效果的影响[33]、[34]、分辨率低以及成本过高[26]、[31]。因此，为了实现TRT的临床转化，探索能够消除亚细胞剂量不确定性的替代方法至关重要。 本文将LA-ICP-MS与毛细管采样技术相结合，用于探测稳定同位素铊在细胞和亚细胞中的摄取情况（详见材料与方法部分）。铊-201是一种在TRT中具有高治疗潜力的MAE发射体，初步研究表明它能通过损伤核DNA产生显著的放射毒性，但需要进一步研究其在亚细胞中的定位[35]、[36]。铊在离子半径和电荷上与钾类似，通过钠-钾泵进入细胞[35]。因此，传统用于LA-ICP-MS的样本处理方法或亚细胞分级方法并不适用于铊。 本文描述的方法能够提供关于药物摄取在细胞和亚细胞中的动力学的独特见解，并有助于新型治疗方案的设计。毛细管采样的另一个关键优势在于其能够选择性地探测细胞内的亚细胞区域，这在我们的研究中是首次报道的。因此，所开发的方法填补了SC-ICP-MS无法实现的分析空白，即能够对单个活细胞内的选定亚细胞区域进行定量分析。

细胞培养

人类胰腺腺癌细胞（PANC-1，Merck）在带通气的组织培养瓶中培养，并在37°C、5% CO₂条件下保存于培养箱中。使用含有高浓度葡萄糖的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Sigma-Aldrich，Merck）以及10%胎牛血清（FCS，Sigma）作为细胞生长培养基。当细胞密度达到约80%时，进行传代并更换培养基。采样前48小时，将约200,000个细胞接种到3.5 cm Nunc玻璃底孔板中。

基底和溶剂优化

我们首先确定了适用于LA-ICP-MS分析的毛细管采样材料的最佳基底，最初使用滴沉积的标准样品（2%硝酸，见表SI 2）。选择标准为：(a) 滴液体积小（≤4 × 4 μm），以最大化样品的面积浓度，从而提高分析通量和灵敏度；(b) 滴液形状清晰，在干燥前后均可见，以便在LA-ICP-MS中重新定位。

结论

我们首次将LA-ICP-MS与细胞和亚细胞毛细管采样技术相结合。该方法为研究细胞和亚细胞中的元素分布提供了巨大潜力。我们的方法使研究人员能够克服商用激光器的限制，实现亚细胞元素定位所需的空间分辨率。此外，该方法还避免了固定和/或洗涤步骤带来的影响。

CRediT作者贡献声明

克莱尔·戴维森（Claire Davison）：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、方法论设计、实验设计、概念构思。 阿比盖尔·库克（Abigail Cook）：实验研究。 凯尔·桑德斯（Kyle Saunders）：实验研究。 艾米丽·A·弗雷泽（Emily A. Fraser）：实验研究。 菲利普·J·布洛尔（Philip J. Blower）：概念构思。 卡塔日娜·沃尔夫迈尔（Katarzyna Wulfmeier）：实验研究。 梅兰妮·贝利（Melanie Bailey）：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、项目监督、方法论设计、概念构思。 丹尼·J.V·贝斯特（Dany J.V. Beste）：原始草稿撰写、资金申请。

资助

本研究得到了萨里大学博士学院以及工程与物理科学研究委员会（EPSRC）（EP/R031118/1、EP/X015491/1）、生物技术和生物科学研究委员会（BB/T007648/1、BB/W019116/1）和自然环境研究委员会（NERC）（NE/T009187/1）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。