《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Identification of Potent Inhibitors Targeting the Pre-Fusion DENV Envelope Protein: A Consensus Physics-and AI-Based In Silico Multi-Tier Screening Approach
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登革病毒包膜蛋白β-OG口袋通过整合Glide docking、AutoDock Vina和GNINA CNN的协同评分方法筛选出五个高亲和力候选化合物，其中CNPD7484经分子动力学和本质动力学验证显示最佳 pocket结合稳定性，为开发新型抑制剂提供候选。
Muthuraja Arun Pravin|Mohammad Aqueel Khan|Sanjeev Kumar Singh
计算机辅助药物设计与分子建模实验室，生物信息学系，Alagappa大学科学楼，Karaikudi-630004，泰米尔纳德邦，印度
摘要
登革热病毒是一种众所周知的虫媒病毒，在全球多个地区造成了严重的后果，每年感染人数达3亿至4亿，几乎一半的世界人口面临感染登革热的风险。目前，尚无针对登革热病毒的特定批准药物，现有的疫苗也存在显著的局限性和使用限制。因此，寻找有效的抗病毒药物仍然是控制疾病传播的关键方法。在本研究中，我们采用了一种协同评分方法来开发登革热病毒包膜蛋白的强效抑制剂，该方法结合了传统的基于物理的（Glide对接）和基于人工智能的（GNINA）评分函数，以严格筛选高亲和力的化合物。本研究利用了多种天然产物数据库（TCM、COCONUT、IMPPAT、CMNPD和SWMD）对登革热病毒前融合包膜蛋白的β-OG口袋进行虚拟筛选。通过一种共识评分方法对候选化合物进行了排名，这些化合物在三种不同的评分方法中均表现优异：Glide XP评分、AutoDock Vina评分和GNINA CNN评分。化合物TCM44233、CNPD7484、IMPPAT5321435、CMNPD28734和RL148展现了良好的结合亲和力和有利的ADMET特性。在顶级候选化合物中，CNPD7484在结合口袋内表现出优异的稳定性，这一点通过延长微秒级模拟、MM/PBSA和关键动力学分析得到了证实。基于这种严格的计算机模拟评估，CNPD7484被确定为一种有效的登革热病毒包膜蛋白抑制剂，需要进一步的实验验证。
引言
登革热病毒是一种在全球范围内造成严重后果的虫媒病毒，每年感染人数达1亿至4亿。然而，世界上仍有一半的人口面临感染登革热的风险。该病毒在许多热带和亚热带国家流行，包括北美、南美、欧洲、非洲和太平洋岛屿[1]。东南亚国家的登革热病例激增，印度在2024年报告了1,86,567例病例和160例死亡[2]。这些数字反映了登革热感染的严重性和威胁性。登革热病毒血清型（DENV 1-4）具有一种称为抗体依赖性增强（ADE）的特殊特性，这对抗病毒药物和疫苗的开发带来了重大挑战。目前只有两种获批准的登革热疫苗：Dengvaxia（CYD-TDV）和Qdenga（TAK-003）。这两种疫苗都是减毒的四价活疫苗，可以提供对所有四种登革热血清型的免疫力[3]。然而，这两种疫苗的使用都有一定的限制。Dengvaxia仅对特定年龄段的儿童和青少年有效，且接种者必须之前曾感染过登革热。登革热病毒主要由Aedes Aegypti和Aedes albopictus蚊子传播。由于水体停滞和快速城市化，蚊子繁殖地急剧增加，导致登革热疫情频发。由于登革热病毒群体中的基因型和血清型多样性，抗病毒药物和疫苗的开发面临重大挑战[4]。
登革热病毒是一种单链正链RNA病毒（+ssRNA），作为病毒蛋白质翻译的mRNA。病毒mRNA被翻译成一个多聚蛋白，然后由宿主和病毒蛋白酶切割。宿主信号肽酶在多聚蛋白的N端进行切割[5]。病毒多聚蛋白的N端区域包含一个信号序列，引导多聚蛋白向内质网（ER）移动。信号肽酶在由病毒结构蛋白组成的特定位置切割多聚蛋白。这些结构蛋白包括衣壳（C）、前体膜（prM）和包膜（E）[6]。这些蛋白在病毒结构形成、传播和复制中起着关键作用。此外，还有七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。这些非结构蛋白不参与结构组装，但在病毒复制、免疫逃逸和病毒致病性中起重要作用[7]。这些结构蛋白和非结构蛋白共同帮助病毒逃避宿主免疫反应，从而成功建立病毒感染。登革热病毒具有与多种细胞类型和宿主受体结合的能力。含有登革热病毒的蚊子唾液通过皮肤上皮细胞进入宿主体内，并与皮肤中的免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞）结合[8]。病毒可以与多种受体相互作用，如DC-SIGN、甘露糖和肝素硫酸盐受体。登革热包膜蛋白是一种重要的结构糖蛋白，在病毒附着过程中起关键作用。成功附着于宿主受体后，病毒颗粒通过网格蛋白介导的内吞作用被细胞吞噬。随后在内体中的酸化过程导致登革热包膜蛋白与内体膜融合，形成孔道以释放病毒基因组。病毒基因组在免疫细胞内复制，然后迁移到淋巴结并扩散到远端器官。
总体而言，登革热的复制周期和致病机制通过包膜蛋白介导的进入机制进行。登革热包膜蛋白是一种关键的糖蛋白，在登革热感染的不同阶段发挥着重要作用。登革热包膜蛋白由外域（Ectodomain）、茎区（Stem region）和跨膜域（Transmembrane domain）组成。包膜蛋白的每个部分在病毒进入、附着和融合过程中都起着关键作用[9]。外域是负责宿主膜融合的核心域，进一步分为三个域：DI、DII和DIII。域I（1–51 & 132–191）包含一个中央β桶结构，作为两个其他域之间的枢纽。域II（52–131）包含一个融合域，其疏水尾部有助于包膜蛋白与内体膜之间的构象变化。域III（192–296）促进宿主受体相互作用，确保病毒包膜正确附着于宿主受体[10]。外域在融合前以二聚体形式存在，在内体酸化过程中转变为三聚体。这种外域的重新排列导致病毒膜与内体膜融合，形成孔道使病毒基因组释放到宿主细胞质中[11]。茎区是外域和跨膜域之间的灵活连接器，有助于膜融合。跨膜域将外域固定在病毒膜上，为病毒包膜蛋白提供稳定性。登革热病毒包膜蛋白是病毒的关键工具，负责病毒附着和感染等过程。因此，在本研究中，我们对登革热病毒包膜蛋白进行了全面分析，特别关注了外域及其融合域以开发抑制剂。我们采用了先进的计算方法，包括在多种天然产物数据库（TCM、COCONUT、IMPPAT、CMNPD和SWMD）中进行的高通量虚拟筛选，以及使用GNINA工具进行基于人工智能的重新评分，以筛选出顶级候选分子。这种共识评分方法为选择高结合分子提供了可靠的方法，并通过分子轨道、分子动力学和关键动力学研究进行了进一步验证，揭示了潜在的登革热包膜蛋白抑制剂。因此，本研究为了解活性位点和外域的构象重排提供了宝贵的见解。
章节片段
目标选择与优化
根据适当的晶体结构检索标准，从PDB（ID:1OKE）中检索了包膜蛋白的外域[12]。使用Maestro 12.4中的蛋白质制备向导对检索到的结构进行了进一步优化。蛋白质制备确保了坐标系统的正确性，如键长、键序、键角或蛋白质的扭转角[13]。氨基酸的侧链、主链、二硫键和氢键得到了正确优化
包膜蛋白结构特征和结合位点分析
登革热病毒包膜蛋白存在两种状态：融合前和融合后。融合前状态对于宿主膜融合和附着至关重要[44]。登革热病毒表面含有多个包膜蛋白。融合前的E蛋白来自PDB（ID: 1OKE），包含394个氨基酸残基[45]。单体E蛋白由三个域组成：域I、域II和域III。域I是一个中央β桶结构，由8个反平行β
结论
在这项研究中，我们采用了一种综合的计算药物发现方法，结合了物理学和人工智能，以识别针对登革热病毒前融合包膜（E）蛋白β-OG口袋的有效小分子抑制剂。这种蛋白在病毒附着、构象重排和膜融合中起核心作用。我们从各种库中筛选了超过五十万的天然产物衍生物化合物，并通过一系列方法进行了仔细过滤
CRediT作者贡献声明
Sanjeev Kumar Singh：监督。Muthuraja Arun Pravin：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，软件，项目管理，方法学，正式分析，数据管理，概念化。Mohammad Aqueel Khan：正式分析
数据可用性
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致谢
作者感谢DST-FIST（新德里[(SR/FST/LSI—667/2016]）；DST-PURSE第二阶段计划[订单号SR/PURSE Phase 2/38 (G)，日期2017年2月21日]；MHRD-RUSA第二阶段[编号F.24-51/2014-U，政策（TN Multi-Gen），教育部，印度政府，日期2018年10月9日]提供的改进基础设施支持；泰米尔纳德邦高等教育委员会（TANSCHE），根据[编号AU: S.O. (P): TANSCHE Projects: 117/2021，日期2021年3月31日，文件编号]。
