综述：将基于纸张的CRISPR/Cas检测方法转化为可穿戴设备形式时面临的技术限制

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Technical constraints in translating paper-based CRISPR/Cas assays to wearable formats

　　莫哈德·阿法克·安萨里（Mohd Afaque Ansari）| 拉沙·伊尔沙德（Rasha Irshad）| 明哈兹·乌丁·艾哈迈德（Minhaz Uddin Ahmed）| 阿吉特·科斯拉（Ajit Khosla）| 易卜拉欣·A·达尔维什（Ibrahim A. Darwish）| 帕纳吉奥塔·M·卡利戈斯菲里（Panagiota M. Kalligosfyri）| 斯特凡诺·钦蒂（Stefano Cinti）
文莱达鲁萨兰大学（Universiti Brunei Darussalam）理学院化学科学项目生物传感器与纳米生物技术实验室，Jalan Tungku Link, Gadong, BE 1410, 文莱达鲁萨兰

**摘要**
基于纸张的CRISPR诊断技术和可穿戴平台在即时分子传感领域取得了显著进展。每种系统都具备独特的能力，包括利用CRISPR酶进行序列导向检测、在纸张基底上进行流体处理和低成本制造，以及通过皮肤安装的设备实现连续样本采集。尽管各有优势，但在无需外部干预的生理条件下运行的实际系统仍然尚未问世。本文评估了这些技术与人体直接接触时所面临的生化、机械和操作方面的限制。主要障碍包括酶在环境条件下的降解、纸张层间的流体控制不稳定，以及信号输出受水分、运动和温度变化的影响。现有策略大多单独解决这些问题，未能充分考虑可穿戴条件下的综合效应。本文将这些挑战重新定义为相互关联的设计问题，并概述了在实验室外实现性能所需的基本系统条件。讨论通过关注材料科学、合成生物学和设备工程中的物理和化学限制，为生物传感器的发展指明了新的方向。

**1. 引言**
疾病、感染或环境暴露的分子特征通常存在于可检测的生物流体中释放的核酸中。与蛋白质或代谢物不同，核酸直接反映了转录活性、病原体负荷或突变状态[1]。然而，其诊断价值主要局限于需要温度控制、冷链物流和实验室仪器的集中式设施[2]。用于检测葡萄糖、乳酸和皮质醇的可穿戴传感器已发展到适合消费者使用的形式，但核酸检测仍受不兼容的检测设计和不稳定的酶成分的限制[3]。缺乏可在现场使用的体内核酸诊断工具，继续限制了早期检测、疫情监测和慢性疾病监控的能力。在新兴传染病、抗菌素耐药性以及持续健康监测需求日益增长的背景下，开发独立于实验室基础设施的分子系统变得尤为迫切。

皮肤界面处的生物流体（尤其是汗液、唾液和间质液）无需侵入性采样即可提供连续的生理信息[4]。尽管已有研究分析了这些流体中的蛋白质和电解质，但由于核酸含量低、易降解且缺乏原位扩增技术，其检测仍存在技术限制。然而，这些流体中含有具有诊断价值的转录本、病原体来源的核酸和循环小RNA（包括microRNA，miRNAs），表明它们在非侵入性分子诊断中具有潜在价值[5,6]。皮脂是另一种存在于皮肤表面的生物流体，其核酸含量尚未得到充分探索，但由于其持续分泌和脂质保护环境，可能具有未被开发的诊断潜力。要从可接触皮肤的流体中提取这些分子信息，诊断平台必须包含能够在实验室外工作的分子识别机制[7]。具体而言，这些限制可以通过在受控环境之外保持酶功能、在多孔基底上维持生化稳定性以及在皮肤界面实现实时自主运行的系统来解决。此外，将分子识别转化为可靠信号需要读出机制，这些机制能够容忍环境变化、降低功耗，并且无需仪器即可解读。

CRISPR相关酶（尤其是Cas12和Cas13）通过目标导向的切割支持可编程的核酸检测[8,9]。新兴系统如Cas14和工程化的Cas变体通过提供紧凑尺寸和降低辅因子要求而扩展了这一能力，适合便携式应用[10]。然而，要充分发挥其在可穿戴应用中的潜力，这些生化反应必须封装在能够高效传输流体、稳定试剂并与皮肤良好结合的材料平台中。基于纸张的基底在这方面提供了一个有前景的解决方案，为微流控路径、长期试剂储存和与冻干生化系统的兼容性提供了被动框架[11]。它们的多孔结构还允许无需泵即可控制流体流动，支持分隔的反应和检测区域的空间图案化[12]。专为表皮接触和流体管理设计的可穿戴系统符合持续体内检测的要求[13]。尽管取得了这些进展，但目前仍不存在能够在环境条件和功率限制下使用纸张基底进行CRISPR检测的集成系统。大多数现有的基于纸张的CRISPR系统仍局限于实验台环境，而支持核酸扩增或序列特异性读出的可穿戴生物传感器也仅处于早期演示阶段。这些系统（包括CRISPR技术、基于纸张的基底和表皮设备）各自独立发展，在关键集成点上存在脱节。因此，当前的局面并非由概念上的限制决定，而是由未解决的生化和机械不兼容性造成的。

因此，本文阐明了阻碍CRISPR诊断、基于纸张的化学技术和表皮设备统一的未解决的生化、物理和机械不兼容性问题。它研究了CRISPR酶在非实验室条件下的性能限制（如脱水、温度波动和低离子强度），并分析了纸张基底带来的限制（特别是与流体不稳定性、材料变形和与可编程检测时间的不兼容性相关的问题）。此外，还考虑了可穿戴部署过程中引入的挑战，如运动、温度变化和长时间接触复杂生物流体对系统性能的影响。总体而言，明确本文的分析立场非常重要。尽管文献中报道了多种CRISPR检测方法、基于纸张的微流控设计和可穿戴传感概念，但它们的共存不应被解读为即将实现实际体内诊断的证据。大多数报道的系统仍只是实验室或半控制条件下的概念验证演示，其转化受到检测化学物质可用性的限制较小，而非根本的生物学、机械和操作限制。因此，本文的目的不是全面分类技术，而是评估在纸张–CRISPR–可穿戴接口处哪些限制占主导地位，哪些设计选择在生理条件下反复失败，以及哪些权衡定义了可穿戴CRISPR诊断的可行设计空间。以下部分将逐步探讨这些限制及其对系统性能的综合影响。

**2. CRISPR + 基于纸张的系统：无需生物物理适应的生化兼容性**
基于CRISPR的诊断技术通过将序列特异性识别与酶驱动的信号生成相结合，重新定义了核酸检测。Cas12和Cas13效应子的附带切割活性促进了高特异性、模块化和低仪器依赖性的检测方法的发展[14]。与此同时，基于纸张的分析设备为即时检测提供了可行的平台，因其毛细作用驱动的流体传输、干燥试剂的环境稳定性和与低成本制造的兼容性而受到重视[15]。这种明显的互补性促使人们开发出将CRISPR–Cas检测的分子精度与基于纸张基底的结构和流体多功能性相结合的系统。早期的努力将CRISPR–Cas系统与侧向流装置、折纸微流控和其他基于纸张的架构结合，创造了低成本格式，以便在实验室外进行序列特异性检测。这些系统代表了向便携式核酸检测迈出的第一步，尽管其性能仍依赖于实验台操作和受控的环境条件。为了系统地评估这些限制，我们首先研究了CRISPR系统与基于纸张的平台之间的生化和基底层面的兼容性（见图1）。

多项研究将CRISPR相关酶整合到基于纸张的格式中，利用纸张的固有特性，如被动流体传输、试剂固定和与冻干的兼容性。CRISPR–Cas12a已应用于基于纸张的诊断格式中，其中标记探针的序列特异性切割产生荧光或视觉信号，无需复杂仪器[15,16,17,18]。基于纸张的分析设备（PADs）允许预加载冻干试剂，尽管大多数检测仍需要离设备扩增或酶激活[19,16,17,18,20]。微流控PADs（μPADs）提供结构化的流体控制和分隔区域，但其制造增加了设计复杂性，但不总是提高检测限[21,22]。侧向流检测通过复合膜上的毛细作用驱动传输，提供了一种简单、低成本且可视化的快速检测格式。在基于CRISPR-Cas的适配中，使用双标记寡核苷酸报告分子，其切割由目标激活的核酸酶决定在测试区和对照区的捕获。这一过程产生信号开启或关闭的反应[23,24]。相比之下，试纸检测通过直接浸入反应混合物实现操作简化，无需集成流体路径[25,26]。

**图1. 体内CRISPR检测的级联故障**
可穿戴设备的故障始于设备与皮肤之间的机械匹配不良。这种不匹配导致纸张–可穿戴接口的破坏并改变微流控通道。接下来，由于流体流动不规则和蒸发，流体控制失败。CRISPR–纸张接口的故障是由于试剂再水化和抑制作用不佳造成的。随后，由于贴合不良和机械应力，可穿戴设备与皮肤之间的匹配出现问题。所有这些因素最终导致诊断失败，没有扩增或信号产生。

**图2. 基于纸张的CRISPR–Cas诊断配置**
(A) 集成扩增、CRISPR检测和侧向流读出的全自由微芯片平台，用于非洲猪瘟病毒（ASFV）检测[20]；
(B) 基于CRISPR–Cas12a的纸张分析设备（PAD）与个人血糖仪（PGM）结合，用于定量核酸检测[18]；
(C) 适用于基于CRISPR的核酸检测的侧向流检测（LFA）格式，使用双标记报告分子[23]；
(D) 基于试纸的、无需仪器的单步CRISPR–Cas13a检测方法，用于从未提取的临床样本中检测SARS-CoV-2[25]。经参考文献[18,20,23,25]许可转载。

尽管基于纸张的平台在CRISPR诊断中得到广泛应用，但仍存在几个核心限制。如表1所示，大多数报道的基于纸张的CRISPR检测依赖于多步骤工作流程和受控的反应条件，这限制了它们直接转化为可穿戴格式的能力。虽然这些系统在实验室条件下表现出高特异性和灵敏度，但它们对外部扩增、精确时间和稳定环境条件的依赖性凸显了概念验证性能与体内应用之间的差距。对可穿戴相关性的定性评估进一步表明，只有部分设计具备连续或集成使用的特性。CRISPR检测的复杂生化需求与基于纸张的平台的物理限制之间存在根本性不匹配。这些平台的被动流体运动特性阻碍了对时间和反应区域的精确控制[27]。这种流体控制的缺乏为依赖核酸扩增的敏感检测创造了设计困境[28]。因此，平台必须采用次优的“一锅法”格式（反应动力学受损）或多步骤离芯片协议（违背了自包含设备的初衷[29,30]，这不可避免地限制了检测灵敏度，阻碍了真正的样本到结果的功能。例如，这些受损的基于纸张的系统的灵敏度通常仅限于皮摩尔或飞摩尔范围，这不足以实现早期疾病检测，远低于金标准实验室测试（如qPCR）所达到的阿摩尔灵敏度[31]。此外，即时检测的核心挑战是上游样本制备，需要从复杂的、富含抑制剂的生物基质中分离出可用的核酸[32]。如下一节所讨论的，潜在解决方案涉及将化学裂解和微固相提取直接整合到纸张基底上。

**表1. 基于纸张的CRISPR/Cas诊断检测概述**
| 目标分析物 | CRISPR系统 | 纸张格式 | 在纸张上的集成程度 | 外部依赖性 | 报告的检测限（LOD） | 参考文献 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| SARS-CoV-2 RNA | Cas12a | 侧向流试纸 | 仅在纸张上读出 | RT-LAMP扩增；加热 | 每次反应10个拷贝 | [33] |
| 非洲猪瘟病毒DNA | Cas12a | 侧向流生物传感器 | 仅在纸张上读出 | PCR扩增 | 未报告 | [34] |
| 非洲猪瘟病毒DNA | Cas12a | 纸张条 | 部分检测集成 | 加热；等温扩增 | 每微升1个拷贝 | [35] |
| 非洲猪瘟病毒DNA | Cas12a | 试纸 | 部分检测集成 | 等温扩增 | 每微升2个拷贝 | [26] |
| SARS-CoV-2 RNA | Cas13a | 侧向流试纸 | 仅在纸张上读出 | 等温扩增；加热 | 每微升10个拷贝 | [36] |
| SARS-CoV-2 RNA | Cas12a | 折纸微流控设备 | 接近样本到结果 | 加热 | 每微升10个拷贝 | [37] |
| 乙型肝炎表面抗原（蛋白质） | Cas12a | 折纸免疫设备 | 接近样本到结果 | 智能手机摄像头 | 每毫升12皮克 | [38] |
| 人类IgG（蛋白质） | Cas12a | 折纸免疫设备 | 接近样本到结果 | 智能手机摄像头 | 未报告 | [38] |
| SARS-CoV-2 RNA | Cas12a | 基于纸张的分析设备 | 部分检测集成 | 个人血糖仪 | 1皮摩尔 | [18] |
| NDM-1抗生素抗性基因 | Cas12a | 色谱纸传感器 | 部分检测集成 | 滚环扩增；加热 | 飞摩尔水平 | [16] |

**2.1 物理重新设计纸张基底以实现精确流体控制**
**2.2 生化改进以减少上游扩增的需求**
针对这些限制，提出了两种主要策略：（1）对纸张基底进行物理重新设计以实现精确的流体控制；（2）进行生化改进以减少对上游扩增的需求。特别是，主要策略是设计能够精确控制流体时空流动的纸张基底。这可以通过蜡印技术制造疏水通道来实现，构建多层结构，其中每一层都作为独立的反应室，或者使用可溶解材料设计可调的流体时间延迟[[39], [40], [41]]。这些特性有助于在单一的、整体的设备中程序化、顺序地执行不兼容的化学步骤，例如核酸扩增后进行CRISPR-Cas检测。然而，这些工程解决方案引入了显著的权衡，包括增加制造复杂性和成本，这可能会削弱纸张作为可访问平台的主要优势。检测的稳健性和重复性也成为主要问题，因为可溶解屏障等功能的性能可能对环境湿度和温度非常敏感。第二种策略是通过提高Cas酶的催化效率或放大产生的信号来消除目标预扩增的需要。前者是通过Cas效应子的蛋白质工程来提高其周转率[25,42]实现的。后者需要使用下游的酶级联反应，其中单个检测事件会触发一个高度放大的次级反应（例如，颜色变化）[43]。这两种方法都增强了每个目标分子产生的信号，以实现临床相关的灵敏度，而无需上游的扩增步骤。这些生化策略无疑是有效的，但它们也引入了新的障碍。例如，为了提高催化速率而对Cas效应子进行工程改造可能会无意中损害其热稳定性或目标特异性，从而导致潜在的脱靶效应[[44], [45], [46], [47,48]]。同样，多酶级联的整合在缓冲液优化方面带来了重大挑战，因为每种酶可能有不同的最佳条件，并且增加了产生背景信号的风险[49]。通过冻干长期储存这些复杂的多组分酶系统仍然是一个重大且经常未解决的问题。潜在的解决方案包括开发单锅式、一体化反应化学方法以及使用新型的冷冻保护剂来确保多酶的稳定性。总的来说，这些限制表明，CRISPR化学与纸质基底的整合不仅受到生化要求的限制，还受到材料物理特性的限制。虽然已经提出了一些工程和生化策略来解决个别挑战，但这些解决方案往往在复杂性、稳定性或重复性方面引入了新的权衡。重要的是，这些限制在静态的、台式配置中无法完全解决。当这些系统被转移到动态的、体表环境中时，它们的影响变得更加明显，因为额外的机械和生理因素进一步影响了性能。这激发了需要在可穿戴设备背景下研究这些系统的需求。

3. 基于纸张的可穿戴设备：为动态生物界面设计静态基底。在第2节描述的生化和流体限制的基础上，将基于纸张的CRISPR诊断技术转化为可穿戴格式引入了与动态生理环境相关的额外复杂性。尽管像侧向流动检测和μPAD这样的静态基于纸张的诊断技术在实验室之外已经实现了先进的分子检测，但它们的架构仍然基本上限于在受控条件下的单时间点测量。这一限制与体表传感的要求形成了鲜明对比，后者必须在机械变形、温度波动和生物流体成分变化的情况下保持连续运行[50]。因此，为了将基于CRISPR的诊断技术扩展到现实世界的、时间分辨的应用中，必须重新考虑基于纸张的平台，不仅作为被动的分析基底，而且作为在持续物理和生化压力下在皮肤界面工作的可穿戴系统组件[51]。可穿戴传感器试图通过皮肤可接触的生物流体（如汗液和间质液）连续获取生化信息，从而实现时间分辨的监测，而不仅仅是单点分析[52], [53]。表2突显了皮肤可接触生物流体中的生理核酸浓度与现有基于纸张的CRISPR系统的检测限之间的根本不匹配。在大多数情况下，报告的分析物浓度低于无扩增检测的灵敏度范围，表明分析限制，而不仅仅是设备架构本身，是可穿戴实现的主要障碍。这种差异强调了需要增强信号放大策略或能够在生理相关浓度范围内工作的替代传感方法。据报道，汗液和间质液中的无细胞DNA和RNA的浓度比实验室条件下基于纸张的CRISPR检测通常处理的浓度低几个数量级。这种不匹配构成了一个根本的灵敏度障碍，仅通过微流控或结构优化无法解决。此外，汗液和皮肤表面含有核酸酶和蛋白水解成分，这些成分在长时间暴露下会降解目标核酸和CRISPR试剂。低分析物丰度和体表生化不稳定性共同定义了连续可穿戴CRISPR传感的主要限制[54], [55], [56], [57]。

表2. 皮肤可接触生物流体中的生理核酸水平与基于纸张的CRISPR检测限的比较。

生物流体 | 核酸类型 | 报告的生理浓度范围 | 代表性的基于纸张的CRISPR LOD | 大约的浓度差距 | 对可穿戴实现的含义 | 参考文献
--- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 汗液 | miRNA（EV相关） | 低fM到aM范围 | fM–pM（Cas12/Cas13纸基检测） | 102–104倍 | 需要扩增和批量采样；不适合连续佩戴 [58,59] |
| 汗液 | 无细胞DNA | 极低，接近分析检测限 | fM–pM | ≥103倍 | 仅适用于间歇性测试；预浓缩不可避免 [60] |
| 汗液 | 总细胞外核酸 | 高度可变，通常低于fM | fM–pM | ≥103倍 | 信号不稳定性占主导；不适合体表连续传感 [59] |
| 间质液（ISF） | miRNA | 低fM范围 | fM–pM | 102–103倍 | 只有通过微针采样和扩增才可能 [61] |
| 间质液（ISF） | cfDNA | 非常低，取决于具体情况 | fM–pM | ≥102倍 | 需要侵入性访问和扩增；限制了可穿戴设备的实用性 [62] |
| 唾液 | 病毒RNA（急性感染） | 间歇性峰值，高度可变 | ～10–100个拷贝/反应 | 取决于具体情况 | 适用于单时间点诊断，不适合连续佩戴 [63] |
| 唾液 | miRNA | 低fM到sub-fM | fM–pM | 102–103倍 | 需要扩增和严格的预处理；可穿戴使用有限 [64] |
| 唾液 | 无细胞DNA | 低ng/mL到pg/mL当量 | fM–pM | 101–103倍 | 适用于间歇性测试；连续监测不现实 [65] |

此外，为了在皮肤表面可靠地管理生物流体，已经开发了粘附皮肤的微流控贴片，可以高效地捕获、传输和分析汗液或ISF[66,67]。汗液分析贴片通常由多层薄而柔性的聚合物（如聚二甲基硅氧烷（PDMS）或聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）制成，通常使用激光和模切等可扩展的制造技术[68,69]。这些贴片具有复杂的流体设计，以管理汗液动态[54]。其他设计采用双流体方法，一个通道用于测量总汗液体积或速率，另一个通道用于目标分析物（如氯化物或葡萄糖）的比色分析[53]。这种配置支持根据汗液速率实时标准化生物标志物浓度。封闭通道设计还减少了样品蒸发并限制了外部污染，提高了定量准确性。关键的是，这些微流控可穿戴设备不仅与皮肤具有机械适应性，还提供了对流体流动的时空控制，这是前一节中提到的静态基于纸张系统的关键限制。

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图3. (A) 使用3D折纸纸基芯片进行汗液生物标志物的多重检测 (i–iii) 通过酶或指示剂反应进行葡萄糖、乳酸、尿酸（UA）和皮质醇的比色检测。(iv-vii) 使用含有普鲁士蓝作为氧化还原报告剂的分子印迹聚合物（MIP）进行电化学皮质醇检测 [70] (B) 受剪纸启发的石墨烯在聚酰亚胺上的传感器，表现出极强的可变形性 (i–iv) 示意图和图像显示了贴合在皮肤上的剪纸图案石墨烯设备，在360°扭转和100%拉伸下能够适应变形。(v,vi) 在手腕弯曲和伸展时在皮肤上的部署，展示了表面适应性 [71] (C) 用于实时汗液分析的纺织集成微流控系统 (a–c) 一种透气、多层纺织基汗液贴片的示意图，具有集成微通道，用于动态汗液传输、速率检测和离子电荷分析。(d–e) 比较纺织嵌入式与PDMS基贴片，强调了更好的透气性和汗液渗透性。(f–j) 大面积、粘附皮肤的图案化纺织微通道和多层布局的制造示例 [54] 经许可从参考文献[54,71]转载。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）

此外，为了获取更具临床价值的ISF，基于纸张的贴片已经与微针（MN）阵列集成[55,56]。这些微针可以无痛地穿透皮肤外层到达真皮中的ISF。微针有多种形式，包括实心、中空、多孔和可溶解结构，每种结构都针对不同的提取或传感策略进行了优化[57,72]。现在，完全集成的可穿戴系统将一次性微针传感器阵列与可重复使用的无线电子设备结合[73]。此外，纸张的固有可折叠性通过折纸（折叠）和剪纸（切割和折叠）被巧妙地利用，创造了复杂的三维（3D）微流控系统和机械弹性结构[74]。基于折纸的设计支持从单张纸片制造多层分析设备。这些架构实现了检测步骤的空间分离，并允许在紧凑的格式中集成多种传感模式[75]。图3A展示了如何使用基于折纸的纸基架构在可穿戴汗液传感器中实现空间分离和多重检测，从而实现并行的比色和电化学读数。另一方面，剪纸通过引入战略性切割，赋予了原本刚性的材料出色的伸展性和应变耐受性[76]（图3B）[71]。这些创新展示了如何重新设计基于纸张的平台以适应动态生理条件，这是将复杂的CRISPR基化学集成到未来可穿戴系统中的关键基础。这些平台能够连续、实时地测量代谢物（如葡萄糖、乳酸和酒精），代表了向最小侵入性生理监测迈出的关键一步[77]。

随着可穿戴生物传感器的不断进步，它们在日常生活中的使用将取决于能够在正常活动中佩戴而不会引起不适或引起注意的柔软、舒适的设计。最终，不显眼的可穿戴传感的目标是融入日常服装中，这一愿景通过基于纺织的平台得以实现[78]。这种方法利用了功能性吸湿纤维（如棉、羊毛和Coolmax纱线），直接缝制到疏水性织物中[79]。疏水性织物将流体流动限制在亲水性纤维中，后者作为灵活的、透气的微流控通道。一个关键优势是与自动化的、高通量纺织制造的兼容性，这使得复杂微流控电路的可扩展和可重复制造成为可能[80], [81], [82]。这些基于纤维的网络可以通过缝合导电纱线（如镀金纱线）与电化学传感器集成，形成活性传感节点。这种配置支持直接在服装内检测分析物[83]。这样的设备表现出固有的灵活性、可穿戴性和耐洗性，使其成为长期、连续生理监测的合适平台[84]。

尽管取得了这些进展，但在人体上部署传感器引入了一系列在受控实验室环境中不存在的操作挑战。可穿戴生物传感器的可靠性取决于其在机械、热和生物噪声中的功能。蒸发和热漂移是两个最显著的环境挑战[85]。在开放或部分密封的系统中，像汗液这样的生物流体的蒸发可能会人为地浓缩非挥发性分析物，导致读数不准确[86]。这已经通过使用PDMS等聚合物制成的封闭通道微流控贴片以及创新的“蝴蝶状”纸配置得到了解决。在这种方法中，聚酯薄膜覆盖了侧向流动路径，以保护样品免受空气暴露，并防止蒸发和之前样品的记忆效应[87]。另一项研究通过一种毛细管-蒸发驱动的微泵解决了这个问题，该泵无需外部驱动即可维持汗液流动。毛细作用引导汗液通过通道，而出口处的受控蒸发保持了连续流动并最小化了样品损失[88]。这些方法直接应对了第2节中提到的流体不稳定性问题，并为将CRISPR诊断技术集成到皮肤兼容的微环境中提供了途径。此外，热漂移是另一个主要障碍，因为大多数化学和酶传感器的性能高度依赖于温度。身体或环境温度的波动会改变反应动力学并导致信号不稳定，这对基于酶的传感器尤其是一个问题。然而，集成的微加热器可以保持恒定温度，但它们增加了复杂性和功耗[89]。更实用的解决方案包括集成共位的温度传感器，允许实时算法校正信号，或者开发在宽温度范围内可靠工作的热稳定材料，如热电材料[90]。

人体的持续运动是可能破坏传感器数据的主要噪声源[91]。来自拉伸、弯曲或扭转的机械变形会在电化学和光学传感器中引入显著的伪影[92]。已经开发了几种策略来减轻这些运动伪影。在材料层面，剪纸架构将传感元件与整体应变机械分离，而像Ecoflex（杨氏模量为125 kPa）这样的柔软、类似皮肤的弹性体改善了贴合接触并减少了产生噪声的相对运动[93]。在系统层面，一种常见的方法是使用冗余传感器（如加速度计或阻抗肺成像（IP）传感器）来同时测量身体运动和生化信号。此外，还可以使用先进的信号处理算法，从自适应滤波（例如递归最小二乘法）到机器学习模型（如循环生成对抗网络（CycleGAN）来计算去除由运动引起的噪声，从而分离出真实的生理数据。传感器与皮肤之间的界面是一个复杂的生物环境，这带来了显著的挑战[94]。持续暴露于生物流体中不可避免地会导致生物污染，包括蛋白质、细胞和其他大分子在传感器表面的非特异性吸附[95]。这一过程可能会使电极失活，阻塞生物受体，并阻碍分析物的扩散，导致信号漂移和最终传感器失效。为了解决这个问题，通常会在表面涂覆防污材料。虽然聚乙二醇（PEG）被广泛使用，但它会随着时间的推移而降解并降低性能[96]。两性离子聚合物，包括聚磺丁烷（pSB）、聚羧基丁烷（pCB）和聚（2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）（pMPC），已成为更好的替代品[[97], [98], [99]]。这些材料形成一层紧密结合的水化层，作为物理和能量屏障，有效阻止蛋白质吸附并提高传感器的长期稳定性。在未来的CRISPR集成可穿戴设备中，这种防污策略对于保持信号准确性至关重要。除了生物污染之外，皮肤本身和设备粘合剂也可能渗出干扰物质，因此需要高度选择性的生物受体和芯片上的过滤机制来确保测量精度。这些观察表明，与可穿戴设备部署相关的挑战并不是独立于前面讨论的生化和材料限制的，而是在实际条件下放大了这些限制。机械变形、环境变化以及持续的流体暴露引入了额外的不稳定性来源，这些因素与CRISPR化学和基于纸张的平台的现有局限性相互作用。因此，要实现可靠的体表性能，需要一种系统层面的方法，综合考虑这些限制而不是孤立地处理它们。

4. 推进基于CRISPR的诊断技术：从便携式格式到可穿戴部署

前面章节中指出的限制表明，仅在检测或材料层面进行改进是不足以实现可穿戴部署的。从便携式CRISPR诊断技术向可穿戴部署的转变需要从孤立的检测优化转向系统级设计。如表3所示，尽管已经探索了几种核酸检测策略，包括电化学传感器和基于PCR的平台在可穿戴格式中的应用，但它们的性能仍然受到前面讨论的相同基本限制的制约，特别是分析物可用性低、环境变化以及生物组件在连续操作下的不稳定性。电化学传感器已成为连续监测各种生物标志物（包括核酸、蛋白质和代谢物）的流行选择。这些传感器依赖于安培法、伏安法和阻抗光谱学的原理，可以直接在皮肤或生物流体（如汗液和间质液（ISF）中实时读取分析物浓度[100,101]。

表3. 目前已知的基于CRISPR/Cas的可穿戴核酸检测设备

设备类型 | 样本获取方式 | 目标 | CRISPR系统 | 体表集成水平 | 读数方式 | 操作时间窗口 | 实际穿戴的关键限制 | 参考文献
--- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | ---
微针贴片 | 间质液 | 无细胞DNA | Cas9 | 体表检测已验证 | 荧光 | 未报告 | 扩散慢和信号积累；光学复杂 [102]
微针贴片 | 间质液 | 细菌DNA | Cas12a | 体表检测已验证 | 荧光 | 约60分钟 | 渗透深度有限；灵敏度受ISF流量限制 [103]
面罩式可穿戴设备 | 呼出气溶胶 | 病毒RNA（SARS-CoV-2） | Cas12a/Cas13a | 可穿戴采样 + 体外CRISPR | 色度法 | 约90分钟 | 不连续；仅事件触发检测 [104]
柔性贴片（无线） | 溶液相（演示） | DNA模型目标 | Cas12a | 类似可穿戴原型（未在体表验证） | 压阻式无线信号 | 未报告 | 体外测试；生物采样未解决 [105]
表皮汗液贴片 | 汗液 | 小分子代理/核酸触发 | Cas12a | 类似可穿戴原型（未在体表验证） | 电化学 | 未报告 | 汗液变化；核酸含量极低 [106]

能够连续检测核酸是可穿戴设备的关键动机，因为它允许实时健康监测和早期疾病检测。在这方面，CRISPR/Cas系统凭借其高特异性和可编程性，已成为一个有前景的解决方案。它们在可穿戴设备中的应用提供了无需复杂设备即可连续检测核酸的潜力，使得诊断更加便捷和实时。然而，将其转化为可穿戴平台并没有消除现有的限制；相反，它暴露了生化性能、材料设计和环境条件之间的额外依赖性。因此，最近的努力集中在开发设计策略上，以提高在非实验室条件下的鲁棒性、集成性和操作稳定性。这些策略不是独立的解决方案，而是试图平衡相互竞争的需求，包括灵敏度、稳定性、可制造性和功耗。因此，以下部分将探讨在可穿戴CRISPR诊断背景下关键的设计方法及其相关的权衡。为了进一步了解可穿戴核酸传感器的最新技术，几篇最近的综述提供了替代技术及其在可穿戴诊断中当前应用的全面概述[61]。

为了应对这些限制，已经提出了几种设计策略，包括模块化检测格式、试剂稳定化和耐温酶系统。II类CRISPR系统的固有模块化特性使得通过引导RNA设计快速重新配置目标特异性成为可能，支持适应性诊断平台。一体式格式通过将多个连续步骤（例如提取、扩增、检测）集成到单个容器或微流控系统中，简化了诊断工作流程（图4A）[107]。这种方法消除了样本转移并减少了错误[108]。例如，mutaSCAN系统将RT-LAMP和CRISPR/Cas12a试剂冻干在单个芯片上，使得检测可以在约30分钟内完成，这对于便携式和可穿戴设备至关重要[109]。然而，这些方法往往引入了权衡，因为简化的流程可能在非理想条件下降低反应效率或灵敏度。同样，冻干技术也被广泛采用以提高试剂稳定性并实现室温存储[110]。虽然有效延长了保质期，但在变化的环境条件下重新水化后保持一致活性仍然是一个挑战。努力开发耐热Cas变体扩大了操作温度范围[111,112]，但尚未系统地证明在波动的皮肤温度下的稳定性能（图4C）[111,112]。总的来说，这些策略表明，在系统设计的某个方面的改进往往会在其他方面引入新的限制，这强调了需要综合优化而不是孤立解决方案。当转化为可穿戴格式时，前面章节中指出的限制会因持续暴露于复杂的生理环境中而加剧。与CRISPR化学和基于纸张的平台的现有限制相互作用，引入了额外的不稳定性来源。因此，要实现可靠的体表性能，需要一种系统层面的方法，综合考虑这些限制而不是孤立地处理它们。

4. 推进基于CRISPR的诊断技术：从便携式格式到可穿戴部署

前面章节中指出的限制表明，仅在检测或材料层面进行改进是不足以实现可穿戴部署的。从便携式CRISPR诊断技术向可穿戴部署的转变需要从孤立的检测优化转向系统级设计。如表3所示，尽管已经探索了几种核酸检测策略，包括电化学传感器和基于PCR的平台在可穿戴格式中的应用，但它们的性能仍然受到前面讨论的相同基本限制的制约，特别是分析物可用性低、环境变化以及生物组件在连续操作下的不稳定性。电化学传感器已成为连续监测各种生物标志物（包括核酸、蛋白质和代谢物）的流行选择。这些传感器依赖于安培法、伏安法和阻抗光谱学的原理，可以直接在皮肤或生物流体（如汗液和ISF）中实时读取分析物浓度[100,101]。

表3. 目前已知的基于CRISPR/Cas的可穿戴核酸检测设备

设备类型 | 样本获取方式 | 目标 | CRISPR系统 | 体表集成水平 | 读数方式 | 操作时间窗口 | 实际穿戴的关键限制 | 参考文献
--- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | ---
微针贴片 | 间质液 | 无细胞DNA | Cas9 | 体表检测已验证 | 荧光 | 未报告 | 扩散慢和信号积累；光学复杂 [102]
微针贴片 | 间质液 | 细菌DNA | Cas12a | 体表检测已验证 | 荧光 | 约60分钟 | 渗透深度有限；灵敏度受ISF流量限制 [103]
面罩式可穿戴设备 | 呼出气溶胶 | 病毒RNA（SARS-CoV-2） | Cas12a/Cas13a | 可穿戴采样 + 体外CRISPR | 色度法 | 约90分钟 | 不连续；仅事件触发检测 [104]
柔性贴片（无线） | 溶液相（演示） | DNA模型目标 | Cas12a | 类似可穿戴原型（未在体表验证） | 压阻式无线信号 | 未报告 | 体外测试；生物采样未解决 [105]
表皮汗液贴片 | 汗液 | 小分子代理/核酸触发 | Cas12a | 类似可穿戴原型（未在体表验证） | 电化学 | 未报告 | 汗液变化；核酸含量极低 [106]

能够连续检测核酸是可穿戴设备的关键动机，因为它允许实时健康监测和早期疾病检测。在这方面，CRISPR/Cas系统凭借其高特异性和可编程性，已成为一个有前景的解决方案。它们在可穿戴设备中的应用提供了无需复杂设备即可连续检测核酸的潜力，使得诊断更加便捷和实时。然而，将其转化为可穿戴平台并没有消除现有的限制；相反，它暴露了生化性能、材料设计和环境条件之间的额外依赖性。因此，最近的努力集中在开发设计策略上，以提高在非实验室条件下的鲁棒性、集成性和操作稳定性。这些策略不是独立的解决方案，而是试图平衡相互竞争的需求，包括灵敏度、稳定性、可制造性和功耗。因此，以下部分将探讨在可穿戴CRISPR诊断背景下关键的设计方法及其相关的权衡。为了进一步了解可穿戴核酸传感器的最新技术，几篇最近的综述提供了替代技术及其在可穿戴诊断中当前应用的全面概述[61]。

为了应对这些限制，已经提出了几种设计策略，包括模块化检测格式、试剂稳定化和耐温酶系统。II类CRISPR系统的固有模块化特性使得通过引导RNA设计快速重新配置目标特异性成为可能，支持适应性诊断平台。一体式格式通过将多个连续步骤（例如提取、扩增、检测）集成到单个容器或微流控系统中，简化了诊断工作流程（图4A）[107]。这种方法消除了样本转移并减少了错误[108]。例如，mutaSCAN系统将RT-LAMP和CRISPR/Cas12a试剂冻干在单个芯片上，使得检测可以在约30分钟内完成，这对于便携式和可穿戴设备至关重要[109]。然而，这些方法往往引入了权衡，因为简化的流程可能在非理想条件下降低反应效率或灵敏度。同样，冻干技术也被广泛采用以提高试剂稳定性并实现室温存储[110]。虽然有效延长了保质期，但在变化的环境条件下重新水化后保持一致活性仍然是一个挑战。努力开发耐热Cas变体扩大了操作温度范围[111,112]，但尚未系统地证明在波动的皮肤温度下的稳定性能（图4C）[111,112]。总的来说，这些策略表明，在系统设计的某个方面的改进往往会在其他方面引入新的限制，这加强了综合优化的必要性，而不是孤立解决方案。当转化为可穿戴格式时，前面章节中指出的限制会因持续暴露于复杂的生理环境中而加剧。与生化稳定性、流体变化和机械应力相关的现有挑战并没有因此而减少。与含有RNase和其他生物分子的复杂体液（如间质液（ISF）或汗液）的持续接触可能会降解引导RNA并干扰酶活性。例如，人体汗液中含有RNase，这些RNase作为对抗RNA病毒的防御机制而被分泌出来，可以直接降解引导RNA[113]。RNA的稳定性高度依赖于外部因素（如各种物质和离子的存在）以及内部因素（如其特定的结构特征和与蛋白质分子的相互作用）。皮肤温度的波动引起的热不稳定性会影响酶活性和RNA完整性，因为过高的热量会使酶变性并促进RNA降解[114]。皮肤来源的污染物（蛋白质、脂质、代谢物）可能会非特异性地结合或抑制CRISPR组件[115]。例如，汗液中的乳酸、葡萄糖和尿素等代谢物可能会与Cas酶活性相互作用或抑制其活性[116]。最后，身体运动引起的机械应力可能会损害设备及其生化组件的结构完整性[117]。已知机械力（如搅拌或振动）会导致蛋白质变性[118]。同样，作为蛋白质的Cas酶也容易受到机械应力的影响，这会改变其构象并降低其催化效率。基于RNA的生物传感器也可以检测外部物理因素（包括机械应力）对RNA行为的影响[119]。在动态变形过程中，设备与活性敏感膜之间的界面波动是一个关键问题。从可穿戴设备中高保真度地获取生物信号需要在皮肤和设备界面处同时具备生化兼容性和强大的机械韧性。像顺应性、延展性和强粘附性这样的特性确保了在动态活动中的持续接触，最小化了运动伪影并保持了信号质量[120]（图4B）[121]。结合生化和机械优化对于在现实世界中运动密集型环境中进行可靠的、准确的生理监测至关重要[120]。

[121]。加入可拉伸或自愈中间层可能进一步改善在长时间或重复机械加载期间的界面完整性。

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图4. (A) 一体式Cas13a检测超灵敏miRNA的方法。(i) 在单个容器中集成RNA提取、等温扩增和基于CRISPR的检测的工作流程，(ii) 模块化分子电路，包括自催化链生成，随后通过T7驱动的信号转录和Cas13a介导的荧光激活[107]。(B) 用于体内cfDNA检测的CRISPR–石墨烯微针贴片。(i) 层状结构，其中CRISPR功能化的微针位于等离子体处理的PDMS上的壳聚糖–CNT界面之上，(ii) dRNP–cfDNA在石墨烯金字塔上的相互作用机制，用于特定目标识别，(iii) 体表应用的示意图，实现间质液中cfDNA的实时电化学监测[121]。(C) 用于高温诊断的耐热CRISPR–Cas13a工作流程。使用耐热TccCas13a酶进行病毒RNA检测的示意图，包括逆转录、LAMP扩增和T7启动子，随后在高温下进行体外转录和RNA报告子的旁路切割[111]。(D) CRISPR–Cas9触发的扩增，用于超灵敏DNA检测。CRISDA工作流程的示意图，其中Cas9-sgRNA复合物启动位点特异性切割，随后通过内切酶介导的链置换扩增和探针标记进行荧光定量[122]。

转载自参考文献[107,111,121,122]。

新兴策略专注于调整检测化学和设备架构以适应可穿戴格式，以克服这些挑战。体温触发的反应利用生理热量（例如37-42°C）来激活CRISPR组件，从而消除了对外部加热元件的需求。例如，由热休克蛋白A6（HSPA6）位点构建的热开关可以在温和的温度升高下触发dCas9表达[123]。这些格式对于需要在紧凑、功率有限的环境中进行自主流体处理、扩增和检测的可穿戴系统至关重要。酶和引导RNA的封装对于保护脆弱的CRISPR组件免受体表降解和干扰以及维持活性和稳定性至关重要[124]。水凝胶和生物相容性聚合物网络可以封装和保护CRISPR组件，并在检测到目标时允许Cas12a介导的切割释放信号[125]。纳米颗粒（NPs）作为多功能载体，提供可定制的尺寸、生物相容性和对核酸的有效保护，并增强细胞摄取。它们的模块化、生物相容性和保护核酸免受降解的能力使它们成为集成到下一代可穿戴设备中的理想选择[126]。对于基于CRISPR的诊断，已经开发了各种NP系统，包括CRISPR-Chip，它将dCas9与基于石墨烯的电子晶体管结合，用于识别基因改变和无需扩增即可检测SARS-CoV-2[127]。Finding Low Abundance Sequences by Hybridization (FLASH)方法是一种利用Cas9蛋白和sgRNAs来分解目标基因以进行测序的技术[128]。同样，CRISPR/Cas9介导的侧向流式核酸检测（CASLFA）使用金纳米颗粒（Au-NP）探针来可视化检测病原体[129]。其他方法包括CRISPR/Cas9触发的切割内切酶介导的链置换扩增（CRISDA）和Cas9诱导的指数级扩增响应（Cas-EXPAR）以实现高灵敏度检测（图4D）[122,131]。

除了分子稳定性外，对多步骤CRISPR反应的精确时间控制对于可穿戴格式中的准确信号处理也至关重要。顺序激活设计通常通过微流控芯片实现，通过无需人工干预的方式精确控制反应动力学。这些设计可以包括蜡界面或毛细管吸液材料，确保每个步骤在最佳时间和环境中发生[132]。预分隔的反应室由柔性聚合物（例如聚二甲基硅氧烷、PDMS）或混合材料制成，对于试剂的容纳、流体流动的管理以及保护生化组件免受外部应力至关重要。这些材料可以制成具有精心设计的通道的微流控贴片，以实现高效的汗液收集和受控的流体流动[133]。尽管这些方法多种多样，但它们大多仍处于概念验证阶段，很少在持续的体表条件下进行评估，这限制了它们在连续可穿戴部署中的相关性。

总的来说，CRISPR诊断技术在体表的应用未来需要从一次性、批量模式的检测向实时、连续响应的平台进行根本性的设计转变[134]。这种转变反映了从简单的纸基测试条到动态、可折叠系统的进步，如第3节所述。这意味着对生物标志物的持续被动监测，例如用于连续无细胞DNA（cfDNA）监测的可穿戴CRISPR微针贴片。虽然CRISPR-Cas9贴片显示出有希望的10天体内稳定性，但其在不同生理条件下的通用性和长期免疫反应的适用性仍然是一个关键考虑因素。实现持续监测需要强大的解决方案，以解决样本提取、试剂稳定性和体内信号转导等问题。尽管取得了进展，但在广泛临床应用方面仍存在系统层面的限制[135]。这些限制包括在动态的身体环境中确保系统的稳健性和可靠性、高效且最小侵入性的样本处理方法，以及提高对低丰度生物标志物的检测灵敏度。目前无需扩增的策略虽然简化了工作流程，但往往牺牲了对低丰度目标所需的超高灵敏度。长期生物相容性、体内稳定性、电源管理和微型化、数据准确性、强大的数据安全性、用户隐私保护，以及明确的监管/伦理框架也至关重要。最终，为了使CRISPR诊断技术成为可行的体内生物传感器，它们必须从概念验证阶段发展到稳健、自给自足且具备商业可行性的系统。

尽管基于CRISPR的诊断技术在特异性和可编程性方面具有显著优势，但与qPCR等成熟方法相比，其广泛临床应用仍面临诸多障碍。除了分析物稀缺的问题外，选择CRISPR效应酶也引入了一个经常被忽视的限制因素。这里回顾的大多数基于纸张的CRISPR诊断系统依赖于Cas12和Cas13系统，因为它们具有附带切割活性并且与等温扩增兼容。虽然这些特性在受控实验室条件下具有优势，但它们是否适合在体表长期使用仍不确定。汗液和间质液是富含RNase的环境，即使是微量的核酸酶活性也会迅速降解引导RNA和报告基因底物，从而影响检测的准确性。此外，大多数Cas酶优化用于缓冲反应条件，对pH值、离子强度和温度波动的耐受性较低，而这些因素在日常活动中的皮肤表面变化很大。因此，Cas12和Cas13在可穿戴设备文献中的主导地位更多反映了实验上的便利性，而非在生理暴露下的实际稳健性。目前，很少有研究系统地评估酶的寿命、信号漂移或在与持续或重复佩戴相关的时间尺度上的错误激活率。这一差距表明，酶的选择本身可能比下游的基底或微流控工程更具限制性，需要在未来的设计中给予更多关注。

4.1 可穿戴CRISPR诊断中的系统限制和故障模式
作为上述限制的延伸，这些限制可以解释为在不同设备架构中普遍存在的系统级故障模式。将这些系统转化为可靠的体内平台仍然受到一系列相互关联的故障模式的制约，而这些故障模式在概念验证研究中往往被忽视。这些限制并非源于孤立的设计选择，而是生化检测与皮肤动态生理环境之间的基本相互作用。其中一些挑战在讨论个别设备架构时已经提到；在这里，它们被汇总起来以强调其在系统层面的持续性。
在生化层面，核酸靶标由于在可获取的生物流体中的低丰度及其易降解性而带来特别严重的限制。与代谢物或电解质不同，汗液和间质液中的核酸浓度通常接近或低于大多数基于CRISPR的检测限，即使使用了扩增策略也是如此。这种稀缺性还因核酸酶的存在以及pH值和离子强度的波动而加剧，这些因素会随着时间的推移破坏引导RNA、报告基因和酶的活性[30,104]。
流体的不可预测性是第二个主要故障模式。汗液的产生本质上是间歇性的，并且在个体、解剖位置和环境条件之间差异很大。汗液分泌量的变化直接影响分析物的稀释度、传输时间和在纸基微流控网络中的停留时间[86,131]。虽然多层贴片和封闭通道设计可以减少蒸发和外部污染，但它们无法完全消除导致检测结果不一致性的流动不规则性，从而影响定量可靠性[136]。
机械变形进一步复杂化了体内操作期间的信号稳定性。拉伸、弯曲和剪切力会改变纸的孔结构，干扰试剂分布，并在电学或光学读数中引入瞬态伪影。尽管具有机械柔性的架构提高了可穿戴性，但在实际运动情况和长期使用下对假阳性和假阴性率的系统评估在可穿戴CRISPR文献中仍然缺乏[133,137]。
温度和环境波动引入了额外的漂移来源。皮肤温度随活动、水分状态和环境条件在空间和时间上变化，直接影响酶的动力学和反应平衡[138]。补偿策略如集成加热器或算法校正会增加系统复杂性、功耗和成本，这些因素在当前设计中很少被明确考虑。

除了技术考虑之外，与成本、可制造性和监管相关的转化限制也带来了进一步的限制。多层纸-聚合物组件、冻干CRISPR试剂和集成电子设备增加了材料和制造成本，挑战了可扩展性和一次性使用的可行性。同时，酶试剂与皮肤的持续或重复接触引发了关于长期生物相容性、保质期和监管审批途径的未解决的问题。总体而言，成功的可穿戴CRISPR平台需要在生化稳健性、流体控制、机械韧性和转化可行性方面进行协调优化，而不仅仅是单个组件的渐进式改进。

4.2 成本、可制造性和转化实用性
除了生化和机械限制外，可穿戴CRISPR诊断的实际部署还受到成本结构和制造复杂性的影响。尽管纸基底本身价格低廉，但大多数可穿戴CRISPR平台依赖于结合纸张、弹性体、粘合剂、微流控薄膜和电子组件的多层组件。这些复合系统的累积成本还因使用冻干酶、标记报告基因和为保持检测功能所需的保护性封装层而增加。
从制造角度来看，许多报道的设备依赖于实验室规模的制造技术，如手动层对齐、试剂点涂和低通量组装，这些技术难以转化为可扩展且可重复的生产流程。即使提出了卷对卷或纺织品兼容的工艺，保持批次间的生化性能一致性仍然是一个挑战[139,140]。
监管考虑也带来了额外的限制。在皮肤上连续或重复使用的可穿戴平台必须满足生物相容性、保质期稳定性和用户安全性的要求，特别是当涉及酶试剂时。目前，很少有可穿戴CRISPR研究明确探讨如何满足或验证这些监管期望，这凸显了概念验证演示与可部署诊断产品之间的差距。

5. 将CRISPR-纸基诊断技术转化为可穿戴平台的系统级限制
前几节概述了如何将纸基底和CRISPR化学成分适应于体内操作，但这些组件整合为可靠的可穿戴诊断系统的进展仍受到系统级集成限制的制约。可穿戴部署同时对流体处理、生化稳定性、机械稳健性、电源自主性和数据可靠性提出了要求，这些要求无法独立解决。它必须结合来自先进学科的原理和已证明的解决方案，包括用于被动流动控制的微重力流控、用于适应性结构变形的软体机器人、用于保持电路稳定性的可拉伸电子器件，以及用于长期生理兼容性的植入式生物医学系统[141]。本节探讨了为什么即使在单个组件技术上可行，这些限制在系统层面仍然存在。

5.1 与可穿戴设备兼容的纸基微流控
尽管存在多种纸基微流控的制造策略，但只有少数几种能够适应可穿戴设备所需的机械变形、流体变化和运动自主性。许多常用于实验室μPAD的方法虽然具有高图案精度，但在反复弯曲、扭转或长时间皮肤接触下缺乏韧性。在可穿戴环境中，微流控架构必须能够在没有外部泵或刚性支撑的情况下维持连续的生物流体暴露[142]。
因此，与可穿戴设备兼容的纸基微流控优先考虑被动、耐变形的设计，这些设计依赖于汗液驱动的毛细流动、封闭通道配置以减少蒸发，以及多层结构以在运动过程中保持通道完整性。可穿戴汗液传感系统提供了在动态生理条件下支持稳定流体处理的工程框架[143]。在这种背景下，通过层压图案化纸层或沉积陶瓷基疏水屏障构建的三维纸基微流控架构建立了结构上稳健且流体隔离的网络。这些平台允许有效地从皮肤表面吸走汗液，同时防止泄漏并最小化相邻检测区域之间的交叉污染风险[144]。
那些在动态应变下无法维持稳定流体传输的方法，无论其在静态条件下的分析性能如何，其转化价值都有限。这一限制大大缩小了适合可穿戴CRISPR整合的纸基微流控策略的范围[145,146]。

5.2 电子器件、电源和信号可靠性作为集成瓶颈
除了生化和流体限制之外，系统级集成还引入了与电源管理、信号采集和长期可靠性相关的额外限制。将电子设备集成到纸基可穿戴设备中带来了常被低估的额外限制。连续的CRISPR反应需要稳定的电源、温度控制和信号转导，然而可穿戴的、贴合皮肤的格式必须在严格的能量和空间限制下运行。无线通信模块虽然实现了数据传输，但增加了系统复杂性和功耗，同时没有解决酶不稳定性、试剂降解或检测漂移等基本生化问题[147]。
此外，在机械变形、温度波动和间歇性生物流体接触下，信号保真度进一步降低。尽管柔性电子器件和纺织品集成电路提高了机械适应性，但它们无法缓解酶降解、引导RNA不稳定或长时间佩戴期间的反应动力学变化[101]。因此，电子设备通常作为支持组件而非核心解决方案，这强调了在系统级数字化之前优先考虑生化和流体稳健性的必要性。

5.3 集成可穿戴CRISPR平台中的跨领域限制
适合可穿戴纸基诊断的Cas酶的开发越来越依赖于生物传感领域之外的进展。基因组编辑、合成生物学、蛋白质工程和极端微生物学的研究产生了具有增强热耐受性、催化效率和缓冲稳健性的Cas同源物和工程变体。这些特性最初是为了在细胞内变化条件下改进基因组编辑而优化的，但在体内操作中遇到的波动性热环境和离子环境中具有概念相关性。对于可穿戴CRISPR诊断来说，主要挑战之一是汗液和间质液（ISF）中核酸的浓度较低，远低于血液等其他体液。例如，汗液中的DNA和RNA浓度可能在10^4到10^6拷贝/mL之间，这比血浆或血清中的浓度低几个数量级[148]。这种低丰度使用可穿戴设备检测核酸构成了重大障碍，因为这些生物标志物的检测限（LOD）必须达到皮摩尔到纳摩尔浓度才能实现实时、连续监测[149]。为了克服这一挑战，基于CRISPR/Cas的系统（如Cas12和Cas13）在受控条件下展示了飞摩尔级的灵敏度。然而，要实现可穿戴格式所需的灵敏度，可能需要额外的策略，如扩增技术或信号增强方法[150]。
此外，一些工程化的Cas变体表现出比传统Cas12和Cas13系统更宽的操作窗口，包括在室温下的活性提高或减少对二价离子的依赖性。定向进化和结构导向设计进一步产生了具有更高周转率的酶，原则上可以补偿可穿戴格式中有限的试剂加载和短暂的检测窗口。然而，这些优势在可穿戴设备背景下大多仍是理论上的，因为大多数变体仅在优化的实验室缓冲液中进行了表征，而不是在汗液或间质液环境中。
从侧向流动检测和工业生物催化中借鉴的稳定策略，如玻璃化、聚合物封装或水凝胶封装，进一步说明了这一挑战的跨领域性质。这些方法可以在干燥储存条件下延长酶的保质期，但将其集成到纸基底中会引入与毛细流动、试剂再水和润湿性相关的权衡。同样，为时间调节或模块化激活设计的复杂Cas配置对纸基微流控架构提出了额外的要求，这些要求在可穿戴格式中尚未解决。
因此，主要限制不是缺乏潜在合适的Cas系统，而是在可穿戴相关条件下缺乏系统的验证。朝着可靠的体内CRISPR诊断技术迈进需要在实际的热、离子和机械应力下对工程化的Cas变体在纸基底上进行实证筛选，并同时优化缓冲化学和材料属性。
除了技术挑战外，向实际应用转化还受到制造复杂性、与多层架构相关的成本增加以及围绕体内核酸诊断的监管不确定性的限制。无需扩增的CRISPR策略减少了工作流程的复杂性，但往往牺牲了对低丰度目标的灵敏度，限制了临床相关性。因此，大多数可穿戴CRISPR系统仍然只是概念验证演示，而不是可部署的诊断平台。
综上所述，这些观察表明，可穿戴CRISPR诊断技术的限制更多来自于生化、机械和系统领域之间未解决的集成边界，而不是缺乏支持技术。克服这些障碍需要选择性地优先考虑设计，并在现实的使用条件下进行严格的验证，而不是继续增加设备的复杂性。6. 未来展望：CRISPR诊断技术、纸质微流控技术和可穿戴传感平台已经沿着不同的路径取得了进展，但将它们整合成一个功能性系统的问题仍未解决。现有的原型依赖于在实验室条件下建立的设计参数，包括受控的温度、保持的试剂活性以及手动启动的检测步骤。这些参数在生理环境中无法发挥作用，因为流体的变化、机械应变和生化污染物会干扰系统的每个阶段。此外，酶、底物和信号领域之间缺乏协调的优化，进一步加剧了这些挑战，突显了系统集成的必要性。尽管如此，仍有三个技术障碍限制了从概念验证到实际应用之间的进展。首先，Cas酶在暴露于空气、pH值波动和低离子强度的环境中会降解。虽然一些工程改造的变体显示出更高的切割效率和更强的耐热性，但它们在脱水或机械应力下仍会失去活性。来自侧向流动方法和水凝胶封装策略的经验表明可能有稳定的途径，但这些方法在可穿戴CRISPR应用中尚未得到充分探索。其次，纸质设备内的流体传输无法可靠地控制检测时间。虽然引入了蜡屏障和可溶解元件来延迟流体流动，但这些方法在皮肤变形的情况下表现不稳定。在这方面，受剪纸材料和定时释放试剂机制启发的模块化架构可能会提高在应变条件下的流量控制精度。第三，信号解释与决策逻辑仍然脱节。未经校准的原始信号强度无法反映出汗率、皮肤温度和试剂活性的变化。这些未解决的问题阻碍了当前系统在非实验室环境下的可靠性和可操作性。引入机载校准组件或内部参考区可以帮助标准化输出，确保在不同生理和环境条件下获得一致且可靠的结果。未来的工作应优先将经过验证的模块组装成紧凑的、自运行的系统。一种设计可以使用具有三个不同层的贴片：上层收集汗液或间质液；中层包含位于有控制流体路径的图案化区域中的冻干Cas酶；底层包含将反应结果转换为可测量信号的光学或电化学组件。每一层应独立工作，同时在流量和时间上保持协调。另一种方法是将诊断元件集成到服装中。微流控线可以将汗液引导到嵌入式腔室中，在那里发生酶促反应。输出可以表现为颜色变化或通过导电纤维传递到附近的读取器。另一种选择是使用一次性粘合贴片，这些贴片携带水凝胶隔室，在接触体液和热量时释放Cas酶。信号生成将依赖于与内部参考标记对齐的可见条带。这些设计反映了空间和功能分隔的优势，正如之前关于模块化分层的讨论中所强调的。此外，监管进展不会允许这些设备获得统一批准。每个组件（如底物、酶、检测化学物质和读取器）都必须通过单独的安全性和有效性标准。此外，对于可穿戴设备的认证需要与体外系统进行单独评估。随着可穿戴诊断技术越来越多地与个人健康数据交互，监管审查还需要涵盖网络安全和数据伦理[151]。涉及移动数据传输或用户通知的信号处理方法将需要数据隐私和网络安全审查。如果没有及早与监管路径对齐，有前景的设计可能会因技术上的优点而停滞不前。每种主要策略都应附带应急设计。如果酶降解不可避免，CRISPR读数可以限制在与流体收集层隔离的单独反应室中。如果被动流量控制仍然不可靠，低功耗热触发器可以替代结构元件。如果不同皮肤类型的信号变化继续干扰输出，内部参考目标可以提供必要的校正。这些备用方法是重要的，但它们必须在特定使用场景下发挥作用。长期应用可能会在不同领域分化。一些系统可以在病原体爆发期间支持公共卫生筛查，尤其是在人口密集或高风险地区。其他系统可能通过随时间跟踪循环核酸来监测癌症或慢性炎症的治疗反应。其他格式可以通过集成到制服、床上用品或其他被动接触表面来支持背景监测。每个方向都需要不同的设计容忍度，但所有这些都将基于相同的基本要求：系统必须能够应对皮肤环境的化学和机械不稳定性，而不是无视这些不稳定性。这意味着需要从单一功能原型转向具有内在耐用性的多功能、自主系统。从这个角度来看，进展不会来自任何单一组件的进步，而是取决于将材料、酶和接口组装成无需外部控制即可运行的完整系统的能力。当可穿戴CRISPR诊断技术不再反映实验室检测的逻辑，而是能够响应人体作为诊断环境的实际情况时，它们才能实现实际应用。7. 结论：基于CRISPR的生物传感技术在分子诊断中引入了新的特异性和可编程性水平。然而，将其适应为完全自包含的可穿戴系统在技术上尚未实现。困难并不在于概念上的不一致，而在于当酶系统、多孔基底和皮肤相关环境被置于操作接近时出现的物理和生化不连续性。正如本综述所概述的，性能受到几个相互关联的限制，包括流体不稳定性、在环境和机械应力下的酶降解以及检测步骤之间缺乏协调的时间控制。这些因素继续阻碍了在非控制环境下的可靠功能。解决这些限制需要设计方法的根本转变。与其修改现有的实验室检测方法以适应可穿戴格式，不如从定义体内操作的生理和机械条件开始系统开发。在这种情况下，酶的稳定化、受控的流体流动和符合性的信号转换不应被视为独立的改进，而应作为统一诊断系统的相互依赖的组成部分。这种整合的有效性将更多取决于一致性而非复杂性。未来的进展将依赖于合成生物学、材料科学、低功耗电子学和软设备工程的协同贡献。这些领域的合作对于克服当前在可穿戴CRISPR诊断中面临的限制至关重要。每个领域都提供了必要的工具，但没有一个学科能够单独解决更广泛的挑战。目标不仅仅是在新环境中复制实验室性能，而是基于韧性、自主性和在现实世界条件下的适用性来定义新的传感标准。这意味着可穿戴CRISPR诊断技术不仅必须能够工作，还必须具有适应性、耐用性，并能够动态响应生物环境（如人体皮肤）的不可预测性，以提供一致可靠的结果。展望未来，将这些技术整合到实用的可穿戴格式中是个性化医疗保健演变的一个渐进但不可避免的步骤。通过现在关注这些挑战，我们正在为未来铺平道路，使可穿戴诊断成为常规，为个人提供实时的、可操作的健康洞察，从而显著改善疾病预防、监测和治疗的效果。随着系统的成熟，它们不仅会提供更准确的诊断结果，还将帮助定义一种新的医疗保健范式，使技术与生物学相结合。