一种用于快速筛选小麦籽粒钙、锌、铁、锰、铜的 X 射线荧光能谱分析方法开发

《Crop Science》：An energy dispersive x-ray fluorescence method for screening grain calcium, zinc, iron, manganese, and copper in wheat

为提升小麦（Triticum aestivum L.）籽粒矿质元素检测效率，研究人员针对早期育种选择需求，利用能量色散 X 射线荧光光谱法（EDXRF）建立了一种无损、多元素快速定量方法。该方法可同时测定钙（Ca）、锰（Mn）、铁（Fe）、铜（Cu）和锌（Zn），并使用微波等离子体原子发射光谱仪（MP-AES）进行验证。结果表明，除铁（Fe）外，其余元素在 EDXRF 和 MP-AES 之间均呈现中高程度相关性，定量限（LOQ）均低于实际样品浓度范围，适用于早期高表型筛选。该方法为小麦育种中的多元素生物强化提供了一种快速、低成本的检测方案。

　　

在现代农业生产体系中，生物强化（Biofortification）作为一种可持续、低成本的营养干预策略，正受到越来越多科学家的关注。其核心是通过育种与农学手段，直接提高主食作物（如小麦、水稻、玉米）籽粒中微量元素的含量，以应对全球低收入人群普遍存在的微量元素营养不良问题。在众多微量元素中，钙（Ca）、锌（Zn）、铁（Fe）、锰（Mn）和铜（Cu）对维持人体健康至关重要，也是生物强化的重要靶点。然而，传统育种中，快速、精准地筛选出富含这些元素的基因型是一大挑战。长期以来，电感耦合等离子体质谱/发射光谱法（ICP-MS/OES）是作物元素分析的“金标准”，但其样本前处理复杂、耗时长、成本高，难以满足育种项目中大规模样本的高通量筛选需求。于是，研究人员一直在探索一种既能保持精度，又能实现快速、无损、低成本检测的替代方法。

为此，一项发表在《Crop Science》上的研究，将目光投向了能量色散 X 射线荧光光谱法（EDXRF）。这种技术无需破坏种子，可直接对整粒种子进行分析，极大简化了流程。然而，现有针对小麦的 EDXRF 方法多集中于锌和铁的测定。能否将其扩展至钙、锰、铜的同步检测，并验证其在早期育种筛选中的可靠性，成为了本研究的核心驱动力。这不仅能拓展生物强化研究的元素谱，更能为小麦育种家提供一个强有力的筛选工具，加速营养强化型品种的选育进程。为了回答这个问题，研究人员 Emily F. Klarquist 等人开展了一项旨在开发小麦籽粒多元素、无损 EDXRF 测定方法的研究，并取得了有意义的成果。

本研究主要采用了EDXRF 校准与验证、MP-AES 参考值测定和无限厚度（infinite thickness）测定等关键技术方法。研究团队收集了来自美国华盛顿、俄勒冈、爱达荷三州六个地点的 70 个小麦基因型的籽粒样本，并额外获取了 10 个高锌基因型材料以扩大校准范围。其中 29 个基因型用于建立 EDXRF 校准模型，另外 41 个用于方法验证。所有样本的参考元素浓度值由微波等离子体原子发射光谱仪（MP-AES）测定获得。在建立 EDXRF 方法时，研究人员对每种元素确定了最佳的测量参数（如电压、电流、滤光片、介质等，详见文档表 1），并确定了实现“无限厚度”所需的最小样本量，以确保 X 射线信号不受样本厚度影响。校准的准确性通过测定系数（r²）和校准标准误（SEC）评估，验证的准确性则通过预测标准误（SEP）和偏差（Bias）来衡量。

结果部分：

3.1 无限厚度与定量限

为满足所有分析元素的测量条件，确定同时分析钙、锰、铁、锌、铜所需的最小样本量为 6 克。通过计算得到各元素的定量限（LOQ，以 mg kg^?1计）分别为：Ca 103.9、Mn 8.5、Fe 3.5、Zn 4.7 和 Cu 1.0。这些值均低于观察到的样品浓度范围，表明该方法具备足够灵敏度用于小麦籽粒中各元素的定量分析。

3.2 EDXRF 校准

EDXRF 信号与 MP-AES 参考值之间的相关性分析显示，Zn、Cu 和 Mn 的校准曲线表现出强相关性（0.89 ≤ r²≤ 0.98）和较低的标准误（SEC），表明这些元素具有良好的校准拟合度。相比之下，Ca 的校准表现为中度相关（r²= 0.71），而 Fe 的校准相关性较弱（r²= 0.39）。作者指出，Fe 和 Ca 的准确度受限可能与 K 和 Mn 的 Kβ 谱线对其 Kα 谱线的干扰有关。尽管如此，该方法对 Zn 的校准精度与先前研究相当，证实了 EDXRF 用于高通量筛选的潜力。

3.3 EDXRF 验证

使用独立的验证集对方法进行评估。结果显示，Ca、Mn、Cu 和 Zn 的 EDXRF 预测值与 MP-AES 参考值之间呈现中度至强线性关系（0.62 ≤ r²≤ 0.93），且平均相对标准偏差（RSD）在 2.1% 到 6.7% 之间。各元素的预测偏差（Bias）均接近零，且统计上不显著，表明 EDXRF 没有系统性高估或低估矿物质浓度。值得注意的是，Fe 的验证相关性（r²= 0.49）虽然仍低于其他元素，但较校准阶段有所改善，且其 SEP 和 RSD 表明该方法在估算小麦样品铁浓度时仍具有合理的准确度和精密度。不过，对于浓度范围较窄的群体，建议进行重复分析以提高 Fe 浓度估算的准确性。相比之下，Mn 的验证相关性（r²= 0.62）较校准阶段（r²= 0.89）有所下降，这可能与 MP-AES 测量变异性较大以及验证集中浓度范围较窄有关。

本研究成功开发了一种可同时定量小麦整粒种子中钙、锰、铁、铜、锌五种元素的无损 EDXRF 方法，并首次证明了 MP-AES 可作为 EDXRF 校准的一种低成本、合适的参考方法。研究表明，该方法适用于早期世代筛选，能够有效区分出表现最优和最差的育种材料，从而支持育种决策。尽管对于铁和钙的测定，其准确性因谱线干扰和样品异质性而受到一定限制，但通过增加测量时间和使用面粉样品有望改善。总体而言，这项研究扩展了无损 EDXRF 方法在小麦中的应用范围，将其从传统的铁、锌分析拓展至钙、锰、铜，为小麦生物强化育种提供了一个高通量、低成本的多元素表型分析工具。这将显著降低育种项目中矿物质表型分析的成本和时间，有助于推动针对多种微量营养元素的生物强化项目，为改善全球营养不良状况提供技术支持。