《Journal of Membrane Science》：Understanding and mitigating fouling in ultrafiltration of exosomes from complex biofluids using threshold-flux-guided operation
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外泌体分离机制及膜污染控制策略研究，采用不同材质和孔径超滤膜处理乳清和干细胞培养上清，发现酸性条件下蛋白质聚集主导膜污染，中性条件下浓差极化是主因。提出阈值通量分批透析策略，有效抑制污染并保持外泌体结构，提高产量和纯度32-41%，为规模化生产提供新方法。
石龙奇|邵一婷|范荣|张新池|郝鹏超|万英华|罗建全
中国科学院过程工程研究所生物制药制备与递送国家重点实验室，北京 100190，中国
摘要
膜分离是一种有前景的体外囊泡（exosome）纯化方法，但其实际应用仍受到严重膜污染以及缺乏对复杂生物流体中运输和污染行为机制理解的制约。在本研究中，以乳清和干细胞培养上清液作为代表性样品，系统地探讨了基于超滤（UF）的体外囊泡分离技术。评估了不同材料和孔径的商业膜，发现亲水性再生纤维素膜（RC300）相比聚醚砜膜具有更高的初始渗透率、更低的蛋白质吸附率以及更好的通量恢复能力。通过串联阻力分析进一步阐明了溶液pH值对污染行为的影响。结果表明，在酸性条件下，蛋白质聚集是导致孔道堵塞和可逆滤饼形成的主要原因；而在接近中性pH值时，由体外囊泡积累引起的浓度极化（CP）成为主要阻力来源。基于这些机制见解，开发了一种基于阈值通量的批式渗滤方法来减缓污染发展。在该策略下，过滤阻力保持稳定，同时实现了高效的蛋白质去除（>96%）并保持了体外囊泡的结构完整性；此外，处理时间也比高操作压力下更短。与传统超速离心法相比，膜分离方法使体外囊泡的产率提高了32-41%，并获得了更高纯度的产品。本研究为体外囊泡的超滤分离提供了机制上的理解，并建立了一种有效的膜工艺，可用于从复杂生物系统中大规模纯化体外囊泡。
引言
体外囊泡是细胞分泌的纳米级细胞外囊泡，直径通常在30至150纳米之间，广泛存在于体液和细胞培养上清液中。作为细胞间通讯的重要介质，体外囊泡能包裹并运输来自母细胞的多种生物活性分子，包括微小RNA、信使RNA和功能性蛋白质。体外囊泡的分子组成可在一定程度上反映来源细胞的生理或病理状态[1]，[2]，这使它们成为癌症[3]、代谢紊乱和神经退行性疾病[4]，[5]，[6]等领域的有前景的生物标志物。此外，某些体外囊泡在组织修复和免疫调节中表现出有益作用，这引发了将其作为治疗递送系统的兴趣[7]，[8]。
然而，有效去除纳米级杂质（如游离蛋白质、核酸和脂蛋白复合物）仍然是体外囊泡分离和纯化的重大挑战。这些污染物不仅干扰体外囊泡的定量分析和分子表征，还显著降低产品纯度，从而限制了其在诊断和治疗应用中的价值[9]，[10]。目前，超速离心法仍是实验室中最常用的体外囊泡分离方法[11]，[12]。然而，这种方法通常处理时间较长，回收率低，囊泡完整性保存不足，且可扩展性差，严重限制了其在大规模生产中的应用。近年来，出现了一系列基于特异性识别或亲和相互作用的分离技术，包括抗体偶联磁珠[13]、磷脂酰丝氨酸亲和捕获[14]和光敏脂质纳米探针[15]。尽管这些方法在某些情况下可以获得高纯度的体外囊泡，但它们通常依赖于昂贵的试剂或复杂的程序，限制了其普遍适用性和可扩展性。
基于膜的分离方法因操作简便、能耗低和连续处理潜力而受到越来越多的关注。分子量截留值（MWCO）约为100-500 kDa的超滤（UF）膜原则上可以通过尺寸排阻作用将体外囊泡与较小杂质分离。然而，由于体外囊泡的纳米级尺寸以及蛋白质的物理化学性质（如静电相互作用和疏水吸附），膜分离过程在分离体外囊泡时仍面临重大挑战，特别是严重的浓度极化和膜污染[16]，[17]。这些问题导致渗透通量迅速下降，分离选择性降低，产品稳定性受损，从而阻碍了高纯度体外囊泡的大规模生产[18]。
为了解决这些问题，人们探索了多种策略，包括开发专用膜模块、优化工艺和使用添加剂。例如，EXODUS平台通过引入振动来减轻生物聚集；由配对振荡器产生的横波和声流可以有效将表面附着的颗粒抬起并重新悬浮在液体中，从而抑制污染和颗粒聚集[19]。Marsh及其同事在37°C下向进料中添加了二价阳离子螯合剂，以促进蛋白质胶束的溶解并减轻污染[20]。此外，增加膜表面的横向流速也被认为是一种有效的减污方法[21]。然而，这些策略往往涉及较高的能耗或复杂的设备，高剪切或高温可能对体外囊泡的结构完整性和生物活性产生不利影响。
在本研究中，使用牛奶和干细胞培养上清液作为模型系统，系统地研究了不同材料和孔径膜对体外囊泡的UF分离行为和污染特性。通过串联阻力模型分析发现，在酸性条件下，预处理过的牛奶中的乳清蛋白聚集是膜污染的主要原因；而在接近中性条件下，通量下降主要由膜表面上体外囊泡的积累引起的浓度极化所主导。基于这一理解，提出了一种基于阈值通量的批式渗滤策略，并结合pH控制，包括多次稀释-浓缩循环。该方法显著降低了浓度极化阻力，有效减轻了膜污染，同时保持了体外囊泡的结构完整性，显著提高了分离效率和产率，为体外囊泡的大规模生产提供了一条可行的途径。
材料
聚醚砜（PES）超滤膜和再生纤维素（RC）膜，分子量截留值（MWCO）为100-500 kDa，由Cobetter Filtration Equipment Co., Ltd.（中国杭州）提供。原料牛奶由北京三元食品有限公司（中国）提供。盐酸（HCl，分析级）购自中国药化试剂有限公司。氢氧化钠（NaOH，分析级）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国）。磷酸盐缓冲盐水
商业超滤膜的筛选
体外囊泡的直径通常在30至150纳米之间[23]，而乳清蛋白的典型分子大小约为9–12纳米[24]。为了实现有效分离，首先评估了两种RC膜和三种不同MWCO的PES膜。在这些实验中，40毫升的预处理乳清进料（预处理后的原料牛奶）被浓缩至5毫升。对于所有膜，在过滤的早期阶段都观察到了明显的通量下降，表明存在严重的
结论
本研究系统地研究了基于超滤的体外囊泡分离过程中的污染机制和控制策略，解决了大规模处理中存在的严重污染、通量迅速下降和分离效率有限等关键问题。以牛奶和羊膜上皮细胞培养上清液作为代表性的复杂生物流体，研究了膜材料和孔径对分离性能的影响，并利用串联阻力模型分析了污染行为
CRediT作者贡献声明
罗建全：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。石龙奇：撰写 – 原始草稿、方法学、实验设计、数据分析。邵一婷：撰写 – 原始草稿、方法学、实验设计、数据分析。郝鹏超：监督、资源协调。万英华：资源协调、项目管理。范荣：监督。张新池：资源协调
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国科学院战略优先研究计划（XDC0290303）的财政支持。
