《HUMAN MUTATION》：Development of a Multiplex Amplification System Using Oxford Nanopore Sequencing for STRs and InDels
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为应对灾祸现场样本难以及时鉴定、传统毛细管电泳(CE)与二代测序(NGS)在通量、便携性和实时性上的局限，本研究开发了名为NanoID的多重扩增系统，整合了29个常染色体短串联重复序列(STR)、29个Y染色体STR、61个常染色体插入缺失(InDel)、2个Y染色体InDel及牙釉蛋白(Amel)基因。研究在112例无关个体样本中对114个位点实现了100%准确分型，并验证了系统的重复性、灵敏度、物种特异性及在全同胞亲缘鉴定中的性能。结果表明，NanoID在DNA输入量≥50?pg时准确率超过99.12%，联合鉴别力与累积排除概率分别达1???7.990?×?10?57和1???2.299?×?10?16，全同胞鉴定的敏感度、特异度与准确率均为100%。该工作为基于纳米孔测序的现场快速法医DNA鉴定提供了可靠方案。
在恐怖袭击、空难、自然灾害等重大突发事件中，现场往往遗留大量严重损毁的遗体，快速、准确地进行个体身份识别成为法医工作的巨大挑战。传统的毛细管电泳技术虽然成熟，但通量有限、对片段长度要求高，且设备庞大，难以部署在现场。二代测序技术能提供更丰富的序列信息，但其工作流程复杂、初始成本高、设备笨重，同样不适用于实时、现场的鉴定需求。近年来，牛津纳米孔技术推出的MinION测序仪，以其实时测序、设备便携（重量不足87克）、高输出等优点，为现场快速DNA分析带来了曙光。然而，其最新的R10.4.1测流池对短串联重复序列（Short Tandem Repeats, STRs）的分型能力尚未得到充分验证，对另一类常见双等位基因标记——插入缺失（Insertions or Deletions, InDels）的检测准确性在早期版本中也罕有研究。为了填补这些空白，并为灾难现场提供一种可靠的即时检测工具，研究人员开展了这项研究。
本研究开发了一套名为NanoID的多重扩增系统，旨在利用纳米孔测序平台，同步检测29个常染色体STR、29个Y染色体STR、61个常染色体InDel、2个Y染色体InDel以及用于性别鉴定的Amel基因。研究人员首先在112名无关个体样本中筛选出所有能100%准确分型的位点，随后对这些位点进行了重复性、灵敏度、亲缘关系推断和物种特异性评估。该研究成果以论文形式发表在《HUMAN MUTATION》期刊上。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：1. 多重PCR引物设计与面板构建：利用Primer Premier和MFEprimer软件设计特异性引物，构建包含目标STR和InDel位点的NanoID扩增面板。2. 样本处理与测序：研究收集了112名中国汉族无关个体的血卡样本，通过两阶段PCR扩增目标片段，并使用牛津纳米孔公司的MinION Mk1C或GridION平台（采用R10.4.1测流池）进行测序。同时，使用MGI公司的MGISEQ-2000RS平台进行二代测序，并使用毛细管电泳平台作为对比基准，以验证数据的可靠性。3. 生物信息学分析：使用Dorado进行碱基识别，使用STRait Razor 3.0进行STR分型，使用CLC Genomics Workbench 24进行InDel分析，并使用Merlin软件计算亲缘关系中的似然比。
3.1. 测序质量
研究使用12个R10.4.1测流池对183个样本进行了测序，93.12%的数据质量值(Q)大于9。数据显示，测序产出与测流孔活性呈正相关，且测序读长分布与文库片段大小范围（170-450 bp）一致，表明纳米孔测序在该片段范围内具有良好的通过一致性。
3.2. 案件样本分型与位点筛选
通过对比纳米孔测序与二代测序、毛细管电泳的结果，研究人员筛选出了错误率较高的位点。最终，保留了25个常染色体STR、26个Y染色体STR、62个InDel和Amel基因，这些位点在112例无关样本中实现了100%准确分型。位点平均测序深度如图1所示，大部分位点深度充足，但DYS389II等位点深度较低。此外，研究人员还分析了等位基因覆盖比，发现大部分STR和InDel位点的等位基因平衡性良好，但Amel等少数位点存在由纳米孔平台系统误差导致的等位基因失衡。
3.3. 重复性与灵敏度
使用标准DNA样本9948进行三次重复实验，所有114个位点均能一致且准确分型，证明了系统优异的重复性。灵敏度测试显示，当DNA输入量低至50 pg时，所有位点均能被检出，准确率达96.76%；若采用“三取二”规则，DNA输入量≥50 pg时准确率超过99.12%。随着DNA输入量降低，测序深度和等位基因覆盖比均出现下降和波动，并出现了等位基因丢失(Allele Dropout, ADO)和等位基因误增(Allele Drop-in, ADI)等现象，其表现与主流二代测序试剂盒相当。
3.4. 亲缘关系测试
研究利用NanoID系统对21对全同胞和11,088对无关个体进行了亲缘关系分析。以对数似然比(log10LR)的-4和4作为阈值时，全同胞鉴定的灵敏度、特异度和准确率均达到了100%，尽管有14.61%的样本对无法给出明确结论（处于中间灰色地带）。这证明NanoID系统在全同胞亲缘鉴定中具有强大的判别能力。
3.5. 物种特异性
研究人员测试了猫、鸡、牛、狗等12种非人物种样本。结果显示，非人样本中仅有少数位点（1-7个）的比对读长超过阈值，且其总比对率（7.78% ± 3.92%）远低于人类样本（41.06%）。这表明NanoID系统能有效区分人类与非人类DNA样本，具有良好的物种特异性。
在结论与讨论部分，作者总结道：本研究成功开发并验证了名为NanoID的多重扩增系统。该系统整合了总计121个STR和InDel位点以及Amel基因，能够利用纳米孔测序平台实现一次性检测。经过系统评估，NanoID展现出高准确性（筛选后位点100%正确分型）、良好的重复性、高灵敏度（DNA输入≥50 pg）、优异的物种特异性以及在全同胞亲缘鉴定中的强大效能（联合鉴别力为1 ? 7.990 × 10?57，累积排除概率为1 ? 2.299 × 10?16）。与传统的毛细管电泳和二代测序相比，基于纳米孔的MinION平台在通量、便携性、检测速度和成本方面具有独特优势，特别适合用于灾难现场等需要快速、实时、现场部署的法医DNA鉴定场景。尽管当前工作流程仍依赖热循环仪等设备，且纳米孔测序在均聚物区域仍存在错误挑战，但随着算法和测序准确度的持续提升，该技术将在法医遗传学中扮演越来越重要的角色。本研究为拓展纳米孔测序在法医学中的应用提供了可靠的技术方案和扎实的实验依据。
