双通道宽场荧光显微镜的信号强度分析及补偿方法

《Optics & Laser Technology》：Signal intensity analysis and compensation for dual-channel wide-field fluorescence microscope

双通道宽场荧光显微镜存在反射通道信号强度显著低于透射通道的问题，导致ROI识别和细胞形态学分析准确率下降。通过ZEMAX仿真发现EM2滤光片在反射通道的波长依赖性吸收是主因，提出基于SNR感知掩膜与先验融合的SAMPF算法，通过物理模型预补偿和动态掩膜优化实现通道间信号均衡，实验表明其可提升反射通道1.8-3.3倍信噪比且SNR损失小于0.5dB，优于传统LIME和Retinex方法。

　　

刘贵倩|叶冠勇|甘天|王玲丽|胡敏|陈同生

中国广东省广州市华南师范大学光电科学与工程学院生物光子学系激光生命科学重点实验室及激光生命科学研究所，510631

摘要

信号强度是影响显微图像清晰度的关键因素。然而，我们观察到双通道宽场荧光显微镜（DC-WFM）的两个通道之间存在显著的信号强度差异，这严重影响了感兴趣区域（ROI）的识别精度，从而影响了定量计算和细胞形态观察的准确性。ZEMAX仿真显示，这种信号不平衡主要是由反射通道中滤光片的幅度衰减引起的。为了解决这个问题，我们开发了一种新的图像增强算法SAMPF（基于信噪比（SNR）的掩蔽和先验融合）。使用Argolight载玻片的实验结果表明，SAMPF能够有效补偿图像信号强度，同时比传统的LIME和Retinex方法更好地保持了图像质量。该算法可以集成到DC-WFM控制系统中，以方便细胞观察并提高ROI选择的准确性。

引言

双通道宽场荧光显微镜（DC-WFM）是现代生物医学研究中的核心工具[1],[2]，它能够同时观察多种分子事件，从而解析复杂的生物过程，如共定位分析或荧光共振能量转移（FRET）。与共聚焦显微镜相比，DC-WFM在较低的照明强度下工作，因此光毒性较低，更适合长期活细胞成像。

然而，荧光图像量化的准确性在很大程度上取决于两个通道信号的均匀性和一致性[3],[4]。依赖于精确通道间强度比的比率测量技术（如FRET成像[5]）特别容易受到通道间信号差异的影响。这种差异源于光学组件（例如滤光片、二向色镜）的波长依赖性特性，导致每个光学路径中的衰减不同。

在我们定制的DC-WFM中，我们观察到了通道间的信号不平衡现象：反射通道的图像灰度值比直通通道的低几倍，有时甚至低一个数量级。这种差异不仅降低了观察的定性效果（降低了对比度），还会在定量计算中引入结构伪影，可能掩盖真实的生物信号[6]，并在关键步骤（如ROI识别）中导致错误。

传统的校正方法，如平场校正（FFC）[4]，主要解决单个视野（FOV）内的空间非均匀性问题。后续的计算方法，如BaSiC和CIDRE[7]，在非稀疏样本（例如密集组织）中往往失效，而深度学习方法（如CARE或Noise2Void[8]）则需要高质量的基准数据进行训练，这又回到了获取可靠标准的问题上。更重要的是，这些方法主要设计用于校正单个通道内的空间阴影，而没有解决不同通道之间的差异，而这正是定量比率成像错误的根本原因。

据我们所知，此前没有研究分析或校正DC-WFM中的通道间信号强度差异。由于这种差异的来源是确定的，源于光学系统的物理特性，我们可以基于第一性原理[9]预先预测照明分布，而无需依赖事后测量。

在这里，我们使用Ansys Zemax OpticStudio对DC-WFM进行了高保真仿真，确定滤光片吸收的波长依赖性是根本原因，并生成了一个基于仿真的物理准确先验用于校正。利用这一先验，我们开发了SAMPF，这是一种基于信噪比（SNR）感知区域的新型图像选择性增强算法。我们的方法结合了物理模型的确定性和计算算法的灵活性，避免了对外部物理标准和不现实数据假设（例如稀疏性）的依赖。使用Argolight载玻片和细胞样本的验证实验表明，SAMPF可以将反射通道的图像信号强度放大1.8到3.3倍，同时保持信噪比（SNR）下降幅度<0.5 dB。这项工作为定量双通道信号校正建立了一条稳健高效的新途径。

系统设置和材料

DC-WFM的系统架构如图1所示。系统包含以下组件：LED光源（PE4000，CoolLED）；物镜（Olympus，20×0.45 NA，LUCPlanFL，Olympus）；滤光片（EM1：ET CFP/YFP/Cy5m；EM2：ET500/100m；EM3：ET520lp）；宽带介质镜（M1/M2：BDM1-A，LBTEK）；二向色镜（DM1：ZT440/514/561/640rpc；DM2：ZT514rdc）；管镜（TTL180-A，Thorlabs）以及相机（CAM1和CAM2，Flash4.0，Hamamatsu）。所有光学元件

通道间的信号强度差异及仿真分析

如图2所示，Argolight荧光载玻片上的目标图案由半径从25 μm到325 μm、步长为25 μm的同心圆组成，外加一个半径为12.5 μm的圆，用于评估我们装置的双通道荧光信号强度。使用三个指标（信噪比（SNR）、最大灰度值$V\_max$和平均灰度值$V\_mean$来定量评估图像亮度和通道照度

SAMPF：基于信噪比感知的掩蔽和先验融合的图像增强算法

为了有效增强低光照图像，提出了SAMPF算法，该算法基于信噪比分析和乘法掩蔽融合。SAMPF的核心流程如图4所示，结合了确定性物理先验和自适应的信噪比感知掩蔽机制。整个过程总结在算法1中，包括三个主要阶段：（1）物理先验系数计算，（2）信噪比感知掩蔽生成，以及（3）噪声抑制和融合。

算法1 基于信噪比感知的掩蔽和先验融合（SAMPF）

结果与讨论

我们将SAMPF算法与常用的传统图像增强算法进行了比较：Retinex算法[14]、通过照明图估计的低光照图像增强（LIME）算法[15]、White Patch算法以及基于深度学习的零参考深度曲线估计（Zero-DCE）算法。图6显示了使用不同算法处理后的增强图像与原始图像的对比。

LIME算法输出的图像中，目标被模糊的阴影包围

结论与未来工作

在DC-WFM的实验操作过程中，观察到两个成像通道之间存在显著的信号强度差异，这影响了细胞形态学研究，并在定量分析中引入了关键错误，包括过度分割、欠分割和目标区域遗漏。通过ZEMAX仿真分析了两个通道中的光传播情况，发现EM2滤光片导致了显著的幅度衰减

CRediT作者贡献声明

刘贵倩：概念构思、撰写——初稿、软件开发、方法论设计、实验研究、数据分析、数据整理。叶冠勇：数据可视化、监督、数据分析、数据整理。甘天：资源提供、方法论设计、实验研究。王玲丽：资源提供、方法论设计、实验研究。胡敏：概念构思、撰写——审稿与编辑、方法论设计、监督、资金筹集。陈同生：监督、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了广东省重点领域研究与发展计划（项目编号：2022B0303040003）和国家自然科学基金（项目编号：62135003）的支持。