《RSC Advances》：Microfluidic toolbox using padlock probes and rolling circle amplification for direct detection and genotyping of viral RNA
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为解决病毒RNA直接检测与变异分型对高灵敏度、高特异性且适用于即时检测（POC）技术的需求，研究人员开发了一种结合微流控、Padlock探针（PLP）与滚环扩增（RCA）的方法。该方法无需逆转录步骤，即可直接检测SARS-CoV-2 RNA并进行单核苷酸多态性（SNP）分型，其检测限可达10-103copies/μL。该研究为开发低成本、自动化、便携式的病毒诊断与基因组监测平台提供了新策略，具有重要的临床转化潜力。
新兴RNA病毒，如引发全球大流行的SARS-CoV-2，对公共卫生构成了持续的威胁。快速、准确且能在资源有限环境下广泛部署的分子诊断与基因组监测技术，是有效应对疫情的关键。然而，目前的主流方法，如聚合酶链式反应（PCR），虽然灵敏特异，但依赖于热循环、精密仪器和专业操作人员，限制了其在即时检测和现场筛查中的应用。此外，用于病毒变异分型的方法，如特异性PCR或测序，也面临着需频繁更新引物、成本高昂或流程复杂等挑战。因此，开发一种无需复杂设备、可快速、高灵敏度地直接检测病毒RNA并鉴别其变异类型的技术，显得尤为迫切。
为应对这一挑战，来自瑞典皇家理工学院的研究团队在《RSC Advances》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种集成的微流控工具箱，将滚环扩增技术与一种名为“Padlock探针”的特殊DNA分子巧妙结合，旨在无需逆转录步骤，直接对病毒RNA进行高灵敏度检测和单核苷酸水平的分型。
研究人员在开展这项工作时，主要运用了以下几项关键技术方法：
首先，他们设计了针对SARS-CoV-2基因组保守区（如RdRp基因）和刺突蛋白（S蛋白）区变异特异性位点的探针系统，包括用于捕获靶标的生物素化锚定探针、用于连接Padlock探针的L型探针，以及针对不同变异（如Alpha、Beta和原始株）特异性单核苷酸多态性设计的嵌合型Padlock探针。其次，他们构建了两种不同结构的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片，用于实现杂交滚环扩增和信号富集检测。样本方面，使用了合成的SARS-CoV-2 RNA（MN908947.3）以及来自瑞典公共卫生署的TRIzol灭活的SARS-CoV-2病毒培养上清（包括Wuhan、Alpha和Beta变异株）。核心实验技术包括：用于病毒RNA捕获和信号放大的杂交滚环扩增；结合T4 RNA连接酶2和嵌合Padlock探针，用于实现高特异性的RNA模板连接及后续信号增强的圆环到圆环扩增；以及通过荧光显微镜结合图像分析或微流控色谱富集技术对滚环扩增产物进行定量。
3.1. 基于芯片杂交的滚环扩增（HybRCA）检测病毒RNA
研究人员建立了一套在微流控芯片内全流程完成的病毒RNA直接检测方法。该方法利用生物素化的锚定探针将病毒RNA捕获在芯片内包被了链霉亲和素的琼脂糖微珠上，再通过L型探针引导Padlock探针进行杂交连接，最后启动滚环扩增。通过对合成SARS-CoV-2 RNA的稀释系列进行检测，他们评估了该方法的性能。结果表明，经过90分钟的等温扩增，该方法可稳定检测到低至3000 copies/μL的RNA浓度，估算出的检测限为1000 copies/μL。该技术展示了在无需复杂热循环设备的情况下，提供“是/否”定性诊断答案的潜力，尤其适用于对单核苷酸分型需求不高的现场快速诊断场景。
3.2. 利用圆环到圆环扩增（C2CA）直接对病毒RNA进行基因分型
为了实现高灵敏度、高特异性的单核苷酸变异检测，研究团队采用了C2CA策略。与单轮滚环扩增相比，C2CA通过两轮连续扩增，可将检测灵敏度提高多达1000倍。他们使用T4 RNA连接酶2连接针对RNA靶标设计的嵌合Padlock探针，以直接识别RNA模板。实验分别检测了SARS-CoV-2 Wuhan株、Alpha和Beta变异株的RNA。检测结果显示，该方法可稳定检测到100 copies/μL的RNA，检测限接近10 copies/μL。他们比较了传统玻片计数与微流控色谱富集两种检测方式，发现后者能将扩增产物富集在微小区域内，从而获得更可靠的定量信号，在低浓度样本检测中表现出优势。
3.3. 多重病毒株检测——基于C2CA的变异谱分析
为了进一步验证C2CA区分不同变异特异性单核苷酸多态性的能力，研究人员检测了包含不同种类和浓度病毒RNA的混合样本。结果表明，该方法能够特异性地检测出混合样本中不同变异株的RNA，并且其量化结果（玻片计数或微流控信号强度）与样本中RNA的含量具有良好的相关性。这证明了C2CA技术不仅可以直接检测RNA，还能有效鉴别不同病毒株之间的特定基因突变。
在结论与讨论部分，作者总结道，本研究提出的两种基于Padlock探针和滚环扩增的互补策略，成功实现了在微流控平台上对病毒RNA的直接检测与基因分型。其中，杂交滚环扩增法可检测低至102-103copies/μL的RNA，而C2CA法则可对单核苷酸变异进行分型，灵敏度达到约10 copies/μL。这证明了无需逆转录和热循环的直接RNA模板连接与等温扩增技术，能达到具有分析相关性的灵敏度。
该研究的重要意义在于，它展示了一种有望替代传统PCR和测序方法的、适用于分散式分子诊断和病原体监测的新平台。通过将高特异性探针、高灵敏度等温扩增与微型化、自动化的微流控系统相结合，该技术为开发低成本、快速、易于操作的现场即时诊断工具提供了坚实的技术基础。尽管在扩增时间、酶促连接效率以及全系统集成方面仍有提升空间，但本研究为未来开发用于资源丰富和资源有限环境的便携式、一体化病毒诊断设备指明了一条清晰的工程化路径。
