《Applied Materials Today》：A low-deformation MAA–NMA hydrogel embedding method enabling trans-scale continuous vibratome sectioning
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低变形甲丙烯酰胺-羟甲基甲丙烯酰胺水凝胶固定系统及跨尺度组织分析平台的构建。该系统通过立体阻碍效应和氢键交联优化聚合稳定性，实现大体积脑及多器官样本的连续振动切片（50微米），支持荧光标记与高分辨率三维重建。创新性在于将分子设计（MAA/NMA配比）与宏观性能（弹性模量1.59-2.36MPa，肿胀率<1.06）精准调控，解决了传统凝胶渗透不足和结构变形问题，为跨尺度生物样本分析提供新范式。
罗亚欣|王文辉|张璐|张新波|Wendbe Elielle Sarah Minoungou|任文强|邓启瑞|Hengfang|Chi Xiao|杨晓全|王亚龙|王晓军
中国海南省三亚市海南大学生物医学工程学院数字医学工程国家重点实验室、海南省生物医学工程重点实验室，572025
摘要
传统的组织包埋方法在处理大体积或跨尺度生物样本时，常常受到试剂渗透不均和机械强度不足的困扰，从而阻碍了高质量连续切片的获得。在这里，我们开发了一种基于甲基丙烯酰胺（MAA）和N-（羟甲基）甲基丙烯酰胺（NMA）的低变形水凝胶包埋系统，通过空间位阻效应和氢键交联实现了稳定且可控的原位聚合。优化的MAA–NMA水凝胶配方（5 wt% MAA–25 wt% NMA，总单体含量30 wt%）表现出最小的膨胀（2D变形< 1.06 ± 0.07）、可调的弹性模量（1.59–2.36 MPa）以及高光学透明度，并且兼容多种荧光标记技术。切割后的表面平整度与琼脂糖相当，同时能够实现高达50 μm的连续振动切片，有效支撑内部空腔，从而减少复杂多器官样本中的撕裂和塌陷。通过将MAA–NMA包埋与振动切片、荧光染色和高分辨率断层成像相结合，我们实现了完整大脑的连续切片（119层），并进行了图谱注册的3D重建，以及整个小鼠大脑的双通道HD-fMOST数据集（轴向采样间距6 μm）。此外，一种灌注辅助的包埋策略使得新生儿小鼠多器官样本的细胞-血管共标记和原位3D可视化成为可能，揭示了单细胞分辨率下的跨器官血管结构。这种低变形水凝胶包埋系统及其相关的“包埋-切片-染色-成像”工作流程为复杂生物组织的跨尺度结构分析提供了一个稳健且可扩展的平台，并为调节基于甲基丙烯酰胺的水凝胶的聚合稳定性提供了通用策略。
引言
高保真度分析生物组织的天然三维（3D）结构对于理解器官形态发生、组织组织和病理变化至关重要[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。为此，连续振动切片结合荧光标记和序列/断层成像是一种适用于全器官和跨尺度组织学研究的有效方法，但对包埋技术提出了严格的要求[6]、[7]。特别是对于富含多种组织类型或大量空腔的大体积样本（例如脑室、头部或出生后小鼠身体），包埋技术必须表现出低组织变形，并提供强大的机械支撑，以促进优异的机械切片性能，同时在切片、染色和高通量序列或体积成像过程中保持细胞、血管和其他组织成分的原位结构信息[8]、[9]、[10]。
由于其物理交联网络提供的优异切片性能，琼脂糖是最广泛使用的振动切片方法。像羟基氧化处理这样的方法可以通过部分表面化学结合进一步改善切片的一致性[11]、[12]。相比之下，基于明胶的包埋方法在处理较大、更难切片的样本（例如人脑）时表现出更好的性能，这一优势可能不仅归因于更简单、更易实现的组织-表面化学交联，还可能因为它们的凝胶膨胀特性与水环境中的组织更为接近[13]、[14]、[15]。然而，无论是琼脂糖还是基于明胶的系统，其大分子的深层组织渗透能力都不足，因此无法为富含空腔的样本提供足够的内部机械支撑。
基于水凝胶的包埋系统作为一种有前景的替代方案出现，因为它们可以提供可调的机械性能[16]、[17]、高水分含量[18]、[19]、[20]以及优异的生物相容性[21]、[22]，同时更好地保留了天然组织结构和分子信号[23]、[24]、[25]。然而，许多水凝胶方法，包括那些为光学透明化和大体积成像开发的方法，主要强调光学透明度和分子通透性[23]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。相比之下，对于控制大样本的聚合稳定性和机械均匀性的关注较少，而这些对于大体积样本的连续振动切片至关重要。特别是，缺乏将单体分子设计（如空间位阻和氢键能力）与聚合动力学、网络结构以及最终宏观切割性能直接联系起来的策略。
为了解决这些挑战，我们认为，通过空间位阻效应和氢键交联强化的甲基丙烯酰胺单体可以用来设计具有改进聚合稳定性和机械强度的水凝胶网络。甲基丙烯酰胺（MAA）和N-（羟甲基）甲基丙烯酰胺（NMA）在这种情况下特别有吸引力（图1）：它们的酰胺官能团和羟甲基提供了丰富的氢键结合位点，而空间位阻效应可以用来调节自由基聚合动力学和网络密度[31]、[32]。通过合理调整MAA/NMA的比例和单体含量，应该可以最小化膨胀，实现机械均匀的网络，并保持高光学透明度和荧光兼容性，从而满足跨尺度连续振动切片的严格要求。
在这项研究中，我们开发了一种基于优化MAA–NMA配方的低变形水凝胶包埋系统，该系统在大体积、富含空腔的样本中稳定了原位聚合，并提供了与振动切片相匹配的均匀机械支撑。我们系统地表征了MAA–NMA水凝胶的膨胀行为、弹性模量和光透射率，并将其切割性能与传统的琼脂糖和明胶基质进行了对比。通过将这种水凝胶与振动切片、荧光染色和高分辨率断层成像相结合，我们实现了完整大脑的连续切片和图谱注册的3D重建，以及双通道HD-fMOST全脑数据集。此外，我们建立了一个灌注辅助的细胞-血管共标记框架，实现了新生儿小鼠多器官样本的跨尺度3D可视化，揭示了单个细胞分辨率下的器官间协调的细胞和血管结构。这些结果共同突显了一种基于空间位阻效应和氢键强化的聚合策略，用于设计支持复杂生物组织跨尺度结构分析的基于甲基丙烯酰胺的水凝胶。
MAA–NMA水凝胶的制备
新鲜的包埋单体溶液的总单体浓度为30%（w/w）。标准的MAA–NMA水凝胶配方包含5%（w/w）MAA、25%（w/w）NMA、1.5%（w/w）N’-甲基丙烯酰胺（MBA）、68.5%（w/w）去离子水和0.05–0.20%（w/w）VA?044引发剂。充分混合后，获得了透明无色的水凝胶前体溶液。
为了进行比较，还准备了10% MAA–20% NMA和15% MAA–15% NMA的配方，
MAA–NMA水凝胶的特性
为了满足大体积生物样本包埋过程中高稳定性和低变形的要求，我们选择了具有空间位阻效应的甲基丙烯酰胺（MAA）和N-（羟甲基）甲基丙烯酰胺（NMA）作为构建xMAA–yNMA水凝胶系统的单体，其中x和y分别表示MAA和NMA的质量分数。我们系统地评估了其凝胶化行为、光学透明度、聚合稳定性、膨胀性能、荧光兼容性、机械性能等
结论
高保真度的3D分析需要包埋介质在跨尺度切片过程中提供稳健的低变形支撑，并保持样本的原始形态和原位信息。在这项工作中，我们通过合理设计一种基于甲基丙烯酰胺的水凝胶系统来应对这一挑战，该系统利用空间位阻和氢键交联来稳定大体积、富含空腔的生物样本中的原位聚合。优化的MAA–NMA水凝胶（5 wt%）
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
我们感谢何志国、张海琦、李浩和杨静在实验中的帮助以及设备调试方面的协助。我们也感谢海南大学生物医学工程学院MOST小组同事提供的技术支持。这项工作得到了脑科学与类脑智能技术-国家科技重大专项（编号2021ZD0201004）和海南省重点研发项目（ZDYF2024SHFZ265）的财政支持。
