综述：用于菌株开发和酶工程研究的体内连续进化技术的进展

《Biotechnology Advances》：Advances in in vivo continuous evolution technologies for strain development and enzyme engineering

在体持续进化技术通过错误 prone DNA 复制、DNA 基础修饰和 DNA 重排三种机制实现微生物快速进化，优化突变谱和筛选策略可提升工业菌株及酶的性能，未来需结合多技术平台突破效率瓶颈。

　　

刘媛|高聪|李晓敏|胡贵鹏|宋伟|魏万清|吴静

江南大学生物技术学院及教育部工业生物技术重点实验室，中国无锡

摘要

进化工程是获得具有高耐受性和生产力的工业菌株以及提高酶性能的关键策略。然而，自然突变率低、体外突变库规模小以及漫长的表型筛选周期限制了这一方法的进一步发展。体内连续进化技术通过在活的微生物细胞内实施突变，提高了突变率，使得菌株或基因能够快速进化，从而解决了这些问题。本文系统地探讨了三种基于易出错DNA复制、DNA碱基修饰和DNA重组的体内连续进化平台。对于每种突变机制，文章讨论了其设计原理、典型应用以及优化突变谱和筛选策略的方法。通过比较这些技术的分子机制、优势与局限性，总结了该领域的最新进展，并指出了进化工程的未来发展方向。总体而言，本文为理解体内微生物连续进化技术提供了连贯的框架，并为菌株开发和酶工程提供了指导。

引言

在自然环境中，物种进化是由随机突变和自然选择共同驱动的（Molina等人，2022年）。随机突变产生了原始的遗传变异，而选择则筛选这些变异并决定进化轨迹；这两个过程共同奠定了生物多样性的基础。然而，在工业环境中，微生物和酶通常需要超越其天然能力（Molina-Espeja等人，2016年）。生产宿主必须经过重新编程，以增强生物合成途径（Zhang等人，2026年）、阻断副产物的形成（Chu等人，2025b；Yuan等人，2025年）、提高辅因子供应（Gao等人，2024年），并增加关键酶的活性，从而提高微生物细胞工厂和生物催化过程的效率（Wang等人，2024a年）。由于我们对微生物代谢和酶的结构-功能关系的理解还不够完善，理性遗传工程往往难以同时平衡细胞生长与产物形成，也难以优化酶的活性和稳定性。作为一种补充策略，进化工程在受控的实验室条件下模拟自然进化，以改进工业微生物和酶的性能，从而弥补了纯理性设计的局限性（?akar等人，2012年；Dragosits和Mattanovich，2013年；Mavrommati等人，2022年；Packer和Liu，2015年；Wang等人，2021a年；Zhu等人，2018年）。这种方法已经培育出了具有理想特性的高性能菌株和生物催化剂，包括对极端环境的耐受性、扩展的底物利用范围、增强的催化活性和稳定性、改变的酶功能，以及对抗生素抗性机制的洞察（Molina等人，2022年；Packer和Liu，2015年；Zimmermann等人，2024年）。

根据进化目标的不同，进化工程可以在多个生物学层面实施，包括：(i) 微生物的适应性进化；(ii) 单个基因的定向进化；(iii) 多个基因的途径级进化。对于工业菌株而言，适应性进化依赖于在特定选择压力下自发发生的突变，需要多轮培养和筛选。由于自然突变的频率极低——大约每10^10个碱基复制中只有1个突变——这种策略本身较为缓慢，通常无法在实际时间框架内实现显著的表型多样化（Declerck等人，2026年；Dragosits和Mattanovich，2013年；Sandberg等人，2019年）。在酶工程中，定向进化通常需要大量的时间和人力来构建和筛选突变库，而突变库的规模受到转化和筛选效率的限制（Arnold，2018年；Chu等人，2024年）。在途径层面上，虽然同时优化多个基因原则上可以更好地实现整个途径的代谢平衡，但这也极大地扩展了组合序列空间。然而，目前还没有任何相关技术能够廉价、快速且大规模地并行表达修改多个基因（Cautereels等人，2024年；Crook等人，2016年；Wu等人，2024年）。这些限制限制了可以探索的序列空间的规模和深度。相比之下，体内连续进化作为一种强大的替代方案，可以直接在活细胞内提高目标基因的突变率，从而连续且自主地生成大量突变群体。这种系统将自然界中需要数万年到数百万年的进化时间压缩到了几天到几周的时间内，极大地提高了传统进化工程的效率（Badran和Liu，2015年；Rix等人，2024年）。

根据其突变原理，体内连续进化技术可以大致分为三类：(i) 基于易出错DNA复制的进化；(ii) 基于DNA碱基修饰的进化；(iii) 基于DNA重组的进化（图1）。本文总结了这三类技术的设计原理和优化策略，并强调了它们在微生物细胞工厂开发和酶工程中的应用。这些进展共同展示了如何利用不同的突变机制来实现快速、可控的进化，以满足工业和生物技术的需求。

基于易出错DNA复制的进化

DNA复制是遗传信息准确传递的基础，高保真度的染色体DNA复制对于维持基因组稳定性至关重要。这一过程由包括解旋酶、拓扑异构酶、DNA聚合酶和DNA连接酶在内的多酶机制完成（Li和O'Donnell，2019年）。其中，DNA聚合酶是负责合成新DNA链的主要酶，通常具有外切核酸酶校正功能：当发生错误时...

基于DNA碱基修饰的进化

DNA修饰涉及一系列化学反应，通过这些反应将功能基团共价连接到嘌呤或嘧啶碱基上，从而生成稳定的修饰DNA状态。这些修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化和脱氨作用（Kouzarides，2007年；Schübeler，2015年）。其中，脱氨作用尤为重要：去除外环氨基会改变碱基的化学结构，导致胞苷-尿苷-胸苷（C → U → T）的转换...

基于DNA重组的进化

DNA重组指的是细胞内DNA片段的交换和重排。这一过程是可遗传变异的主要来源，因此对生物进化至关重要（Gaut等人，2007年；M. Real等人，2020年；Schumer等人，2018年）。利用重组机制，已经开发出多种基因组进化技术，这些技术可以大致分为两类：(i) 基于DNA位点特异性重组的技术；(ii) 基于...

结论与未来展望

本文系统地回顾了基于三种基本突变机制（易出错DNA复制、DNA修饰和DNA重组）的体内连续进化系统。这三类技术在突变率、目标窗口和谱型方面存在显著差异，因此适用于不同的进化目标。

基于复制的系统提供了最广泛的突变谱型，几乎涵盖了所有类型的碱基替换，但设计...

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32470059）和中央高校基本科研业务费（项目编号：JUSRP202504026）的支持。