受生物启发的非晶ZIF纳米装甲界面组装技术，用于实现对粗蔗糖合成酶的稳健直接固定

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Bioinspired interfacial assembly of amorphous ZIF nanoarmor for robust direct immobilization of crude sucrose synthase

通过设计生物启发的纳米装甲策略，利用聚电解质-离子液体复合载体实现酶活性与稳定性的协同优化，突破传统固定化酶的活性-稳定性矛盾。研究采用聚乙烯亚胺功能化苯乙烯马来酸酐纳米球（PEI-SMA）作为双功能载体，通过静电吸附粗提酶并预富集Zn2?，结合藻酸盐与低浓度2-甲基咪唑的仿生矿化调控，形成非晶态ZIF保护层。该结构兼具高孔隙率（减少扩散限制）和机械化学稳定性（防止酶变性），使粗酶液活保留率达71.4%，循环5次后活性保持75.7%，在60℃/pH5.5条件下的稳定性较游离酶提升2.6-1.3倍。

　　

张硕|赵丽婷|李婷|丁忠阳|董伟夫

教育部合成与生物胶体重点实验室，江南大学化学与材料工程学院，中国无锡市蠡湖路1800号，214122

摘要

酶的固定化对于工业生物催化至关重要，但本质上受到活性与稳定性之间权衡的限制。刚性保护支架往往由于严重的扩散障碍或蛋白质变性而降低催化效率。为了解决这一挑战，我们通过在聚乙烯亚胺功能化的苯乙烯马来酸酐纳米球（PEI-SMA）表面进行界面组装，开发了一种受生物启发的“纳米装甲”技术。首先，通过静电吸附将粗蔗糖合成酶固定在阳离子PEI-SMA表面上，有效地绕过了纯化步骤，并减轻了后续前体离子引起的蛋白质变性。随后，PEI-海藻酸盐（SA）系统的协同作用促进了保护性涂层的形成：PEI在纳米球界面协调Zn²⁺，而SA通过与亚化学计量的2-甲基咪唑（2-MeIm）的仿生配位诱导了即时成核。这种双重控制策略结合了非平衡配体比例和快速成核动力学，抑制了晶体生长并定向沉积了非晶态ZIF（PEI-SMA@enzyme-Sazif）。这种核壳胶体结构通过其非晶态基质规避了扩散限制，同时确保了优异的稳定性。该生物催化剂表现出较高的活性保留率（71.4%）和良好的重复使用性（5次循环后仍为75.7%），优于PEI-SMA@enzyme。此外，它在60°C和pH 5.5条件下孵育60分钟后，其残余活性分别比游离酶高出2.6倍和1.3倍。这项工作展示了如何通过合理设计胶体生物界面和界面生物矿化途径来协调稳定性与活性的矛盾，从而直接从粗酶提取物中实现高效稳定的生物催化。

引言

酶的固定化是工业生物催化的基石，它促进了制药、生物能源和精细化工领域的酶再利用和稳定性提升[1]。从胶体和界面的角度来看，酶的固定化涉及固体-液体生物界面处的酶-支架相互作用，其中表面电荷、局部配位环境和质量传递特性等物理化学因素对催化性能至关重要[2]。然而，传统的固定化策略通常依赖于传统的支架和协议，这些方法和协议存在固有的局限性[3][4]。具体来说，无机支架（如介孔二氧化硅）提供了机械刚性，但往往需要复杂的官能化处理以防止酶的泄漏[5]。相反，有机聚合物支架具有优异的生物相容性和丰富的结合位点，但其柔性结构通常需要外部加固才能承受苛刻的操作应力[2]。此外，无载体策略（如交联酶聚集体（CLEAs）受到内部扩散障碍和脆弱机械完整性的限制[6]。为了弥合这些差距并克服这些持续的权衡，金属有机框架（MOFs）作为一种非常有前景的替代支架出现，它们提供了可调的架构以实现稳健的酶稳定[7]。在MOFs中，沸石咪唑酸盐框架（ZIF）因其基于咪唑的连接剂而脱颖而出，它们能够通过刚性的晶体框架最小化酶的构象波动[8]。然而，这种结晶性也带来了两个关键限制。首先，酶在苛刻的合成条件下（特别是在MOF形成过程中暴露于高浓度的金属离子（如Zn²⁺）和有机配体（2-甲基咪唑，2-MeIm）时会发生结构变性和不可逆的活性损失[9][10]。其次，由此产生的致密晶体晶格会形成扩散障碍，限制底物接近酶活性位点，从而大幅降低催化效率[11]。尽管MOF吸附方法可以缓解这些扩散限制，但它们无法提供足够的保护以防止蛋白质变性，导致酶的快速泄漏或展开[12]。总体而言，这些挑战使ZIF的应用局限于稳定性-活性权衡可接受的小众领域，阻碍了其在高性能生物催化中的广泛应用。

迄今为止，改进基于ZIF的酶固定化的努力主要集中在减轻结晶性或蛋白质变性上，但很少有策略同时解决这两个限制[13]。例如，调整合成参数（如降低金属离子浓度）可以减少蛋白质变性，但会削弱框架的结构稳定性，导致酶的泄漏[14]。最近的一种无溶剂固态方法通过消除水中的金属离子来避免蛋白质变性问题，但仍面临反应时间长和酶负载量低的挑战[15]。同样，使用添加剂（如表面活性剂）来抑制结晶性通常会降低框架的孔隙率，限制底物的扩散[16]。其他方法，如使用单宁酸创建中空或多孔结构的ZIF，可以更好地保持酶活性并增强底物扩散；然而，蚀刻过程存在框架崩塌的高风险，限制了其实际应用[11][17]。这些权衡突显了需要一种根本性的新方法，该方法利用MOFs的优势（如结构刚性和合成多样性），同时通过仿生设计规避其结晶性带来的缺点。此外，该领域仍然依赖纯化的酶，而忽略了直接使用成本效益高的粗提取物的核心工业原则[18]。

在这里，我们通过合理设计胶体生物界面以及克服对纯化酶需求的实际限制，开发了一种受生物启发的纳米装甲策略，以克服基于MOF的固定化中的稳定性-活性权衡。海藻酸盐在调节Zn²⁺配位和引导酶-载体界面处非晶态矿物沉积方面的作用，类似于天然生物矿化中有机基质的作用，其中受控的离子组装控制了矿物的生长和结构。聚乙烯亚胺功能化的苯乙烯马来酸酐纳米球（PEI-SMA）起到了双重作用：一方面，其刚性的阳离子骨架通过静电相互作用稳定了粗蔗糖合成酶的多聚体构象，有效保护酶免受游离金属离子或有机配体在前体暴露过程中的变性；另一方面，PEI的阳离子表面在初始混合过程中将Zn²⁺牢固地锚定在纳米球上，形成了局部富锌的微环境。当加入亚化学计量的2-MeIm和海藻酸盐（SA）时，SA利用其仿生配位能力在PEI-SMA界面直接触发快速异相成核。使用低浓度的亚化学计量2-MeIm进一步抑制了有序晶格的组装，形成了非晶态ZIF涂层（记为PEI-SMA@enzyme-Sazif，其中Sazif表示由SA模板化的非晶态ZIF）。这种非晶态ZIF层消除了晶体MOFs固有的扩散障碍（使底物能够无障碍地接近活性位点），同时提供了优异的机械/化学稳定性（保护酶免受变性应力）。总体而言，这些特性使生物催化剂实现了较高的活性保留率（71.4%）和良好的重复使用性（5次循环后仍为75.7%），相比裸露的PEI-SMA@enzyme有所提升。此外，它在60°C和pH 5.5条件下孵育60分钟后，其残余活性分别比游离酶高出2.6倍和1.3倍。总体而言，这项工作提出了一种受生物启发的界面组装策略，将PEI-SMA支架与海藻酸盐诱导的生物矿化结合，构建了非晶态ZIF纳米装甲。通过直接从粗提取物中固定酶并缓解晶体框架典型的扩散限制，这种方法为解决基于MOF的生物催化中的稳定性-活性权衡提供了一条有前景的途径。

材料

有关材料的详细信息请参见补充材料。

基因克隆和异质表达

从Nitrosospira multiformis中获得了蔗糖合成酶的编码序列（NCBI访问号：WP_011381564.1），并将其克隆到pET28a载体中[19]。通过全质粒PCR扩增进行了定点饱和突变，然后将所得质粒通过转化引入大肠杆菌细胞中[20]。重组细菌菌株在Luria-Bertani（LB）培养基中培养

受生物启发的非晶态ZIF纳米装甲设计

出于克服酶固定化中固有的活性-稳定性权衡的需求，我们的研究探讨了四种不同的系统（图1）：包括游离酶（对照组，图1a）、PEI-SMA@enzyme（图1b）、PEI-SMA@enzyme-ZIF（图1c）和PEI-SMA@enzyme-Sazif（图1d）。图1d的设计基于一个特定的机制假设：我们提出刚性的阳离子PEI-SMA可以作为双重功能支架，预先浓缩酶和金属离子

结论

总之，这项研究提出了一种受生物启发的纳米装甲策略，通过合理设计胶体生物界面有效地解决了酶固定化中长期的活性-稳定性权衡问题。关键的创新在于PEI-SMA载体、SA和亚化学计量的2-MeIm之间的协同作用。这种独特的组合触发了快速的界面生物矿化，形成了保护性的非晶态ZIF涂层，从而有效地

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响所报告的工作。

CRediT作者贡献声明

董伟夫：写作 – 审稿与编辑，监督，资源管理，项目协调，资金获取，概念构思。丁忠阳：资源管理，方法学，概念构思。李婷：项目协调，数据分析，概念构思。赵丽婷：方法学，数据管理，概念构思。张硕：写作 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学，实验研究，数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（NSFC）（编号：52273089，52573112）的支持。