《Journal of Fungi》：The Oligosaccharyltransferase Catalytic Subunit PsSTT3B Is Required for Asexual Development and Pathogenicity in Phytophthora sojae
Quanhe Ma,
Borui Zhang,
Tongshan Cui,
Shanshan Chen,
Shan Geng,
Fan Zhang,
Can Zhang and
Xili Liu
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本研究聚焦大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）致病力机制，针对其N-糖基化途径中寡糖基转移酶（OST）催化亚基PsSTT3B的功能未知问题，开展了系统性研究。研究人员通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除与回补技术，揭示了PsSTT3B是调控病原菌营养生长、无性繁殖（孢子囊与游动孢子产生）、化学趋性及致病性的关键因子。该基因缺失还会导致菌体对内质网应激物（如衣霉素TM和二硫苏糖醇DTT）敏感性增加，并影响ConA结合糖蛋白谱。该研究首次明确了PsSTT3B在大豆疫霉菌发育与致病中的核心地位，为深入理解卵菌致病机理及开发基于糖基化通路的新型防控策略提供了重要靶点和理论依据。
在大豆种植区，一种名为大豆疫霉（Phytophthora sojae）的微小生物常常让农民头疼不已。它是一种属于卵菌纲的病原体，能够引发大豆的根腐病和茎腐病，造成严重的经济损失。尽管科学家们对其效应蛋白和与宿主的互作已进行了大量研究，但在其自身发育和侵染过程中，一种普遍而关键的蛋白质修饰——N-糖基化（N-glycosylation）——所扮演的角色，尤其是在大豆疫霉中，仍有许多谜团待解。N-糖基化就像给蛋白质贴上“质量合格”和“运输地址”的标签，对蛋白质的正确折叠、稳定、运输和分泌至关重要。执行这一贴标签任务的“核心机器”是内质网中的寡糖基转移酶（Oligosaccharyltransferase, OST）复合体，而其中的“核心操作员”便是STT3催化亚基。有趣的是，在包括大豆疫霉在内的许多卵菌中，存在STT3A和STT3B两个“孪生”基因。之前的研究发现，敲除PsSTT3A是致死的，而部分沉默它会严重影响病菌的生长发育和致病力。那么，它的“兄弟”PsSTT3B又承担着怎样的职责？它与PsSTT3A是分工协作还是功能冗余？它对大豆疫霉至关重要的无性繁殖（如产生可游动、寻找寄主的游动孢子）和成功侵染大豆又有何影响？为了解答这些问题，以Quanhe Ma, Borui Zhang, Tongshan Cui, Shanshan Chen, Shan Geng, Fan Zhang, Can Zhang和Xili Liu组成的研究团队，在《Journal of Fungi》期刊上发表了一项深入研究，系统阐明了PsSTT3B在大豆疫霉菌生物学过程中的核心功能。
为了深入探索PsSTT3B的功能，研究人员运用了多种关键技术。首先，他们通过生物信息学分析和实验验证，鉴定了大豆疫霉中的PsSTT3B基因，并对其进行了系统进化和结构域分析。研究的核心是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功构建了PsSTT3B的完全敲除突变体，并进一步通过原位基因回补技术获得了回补菌株，这为严谨的基因功能验证提供了材料基础。利用这些遗传材料，研究人员开展了一系列详尽的表型分析，包括测量菌丝生长、计数孢子囊和游动孢子产量、检测游动孢子萌发和化学趋性（以大豆异黄酮为引诱剂），以及在大豆叶片和黄化苗上进行致病力测定。此外，还通过药物（衣霉素TM和二硫苏糖醇DTT）处理评估了突变体对内质网（ER）应激的敏感性，并利用ConA（伴刀豆球蛋白A）凝集素印迹分析了全菌糖蛋白谱的变化。转录水平分析则采用RT-qPCR技术，检测了PsSTT3A和PsSTT3B在不同发育阶段和侵染过程中的表达模式。
3.1. Identification and Evolutionary Characterization of PsSTT3B in P. sojae
研究人员首先确认PsSTT3B编码一个含733个氨基酸的蛋白，具有OST催化亚基典型的STT3/PMT_2超家族结构域和保守的WWDYG、DXXK基序。系统发育分析显示，PsSTT3B与卵菌的STT3B聚类，而多数真菌只有一个STT3基因，提示卵菌中STT3基因的复制与功能分化。
3.2. Transcriptional Profiling of PsSTT3A and PsSTT3B Across Development and Infection
表达谱分析揭示了PsSTT3A和PsSTT3B表达模式的差异。PsSTT3B在孢子囊阶段表达量显著升高，而在游动孢子阶段PsSTT3A表达量极低，暗示PsSTT3B可能在游动孢子相关功能中起更重要作用。在侵染早期（3-24小时），PsSTT3B转录水平也显著上调。
3.3. Targeted Disruption of PsSTT3B via CRISPR/Cas9-Mediated Gene Replacement
研究成功利用CRISPR/Cas9技术获得了两个独立的PsSTT3B敲除突变体（T3B-55和T3B-162），并通过PCR和RT-qPCR证实了基因的完全缺失。有趣的是，在敲除突变体中，PsSTT3A的转录水平出现了补偿性上调。
3.4. PsSTT3B Is Required for Vegetative Growth and Asexual Development of P. sojae
表型分析表明，PsSTT3B的缺失导致了一系列发育缺陷：
- 1.
营养生长减缓：突变体菌落直径比野生型减少了约12%。
- 2.
无性繁殖严重受损：突变体产生的孢子囊数量减少了约54%，释放的游动孢子数量减少了超过60%。
- 3.
游动孢子功能缺陷：突变体来源的游动孢子萌发率降低，萌发管变短。
- 4.
化学趋性减弱：突变体游动孢子对大豆异黄酮的趋化反应显著下降。
这些缺陷在基因回补菌株中都得到了恢复，证明表型确实由PsSTT3B缺失引起。
3.5. PsSTT3B Is Required for P. sojae Virulence
致病力测定显示，PsSTT3B敲除突变体在大豆叶片上引起的病斑面积减少了约20%，在黄化大豆幼苗上引起的病斑也显著小于野生型，表明其致病力显著减弱。
3.6. PsSTT3B Is Required for ER Stress Tolerance
PsSTT3B缺失突变体对衣霉素（TM，一种N-糖基化抑制剂）和二硫苏糖醇（DTT，一种诱导ER应激的还原剂）更加敏感。同时，TM和DTT处理能诱导PsSTT3B的表达上调。这表明PsSTT3B有助于维持内质网稳态，应对折叠压力。
3.7. Deletion of PsSTT3B Modifies the Profile of ConA-Binding Glycoproteins in Mycelium
凝集素印迹分析发现，PsSTT3B敲除突变体中一些能被ConA（识别高甘露糖型N-糖链）结合的糖蛋白信号减弱，这为PsSTT3B功能缺失影响体内糖基化过程提供了生化证据。
研究结论与意义
本研究的结论明确：PsSTT3B是大豆疫霉菌中OST复合体的一个关键催化亚基，对其营养生长、无性发育（特别是孢子囊形成、游动孢子产生与功能）和完全致病力都是必需的。该基因的缺失还会削弱病原体对内质网应激的耐受性，并改变其糖蛋白组谱。
这项研究的意义深远。首先，它首次系统阐明了PsSTT3B在卵菌病原体发育和致病中的多重关键作用，将N-糖基化通路与游动孢子特异性功能（如化学趋性）直接联系起来，深化了对卵菌生物学复杂性的理解。其次，研究揭示了PsSTT3A和PsSTT3B可能存在功能分工而非简单冗余：PsSTT3B在游动孢子阶段高表达且功能关键，而PsSTT3A在此阶段表达量极低；敲除PsSTT3B会引起PsSTT3A的补偿性上调，但不足以弥补功能缺失。这提示两者在调控上相互关联，但在特定发育环节各有侧重。最后，也是最具应用潜力的方面在于，PsSTT3B作为一个重要的致病力决定因子，为防控大豆疫霉病提供了新的潜在分子靶标。针对此靶标，未来或可探索开发新型杀菌剂，或利用寄主诱导的基因沉默（HIGS）、喷洒诱导的基因沉默（SIGS）等生物技术手段进行干扰，从而开辟疾病防控的新思路。当然，鉴于N-糖基化通路在真核生物中的高度保守性，任何实际应用都必须充分考虑其对非靶标生物的安全性。总体而言，这项研究不仅填补了卵菌糖生物学领域的知识空白，也为作物卵菌病害的绿色防控策略研发奠定了重要的理论基础。
