《Journal of Fungi》：Unlocking the Potential for Genetic Engineering of the Straw-Degrading Mushroom Stropharia rugosoannulata by Constructing a CRISPR/Cas9 Gene Editing System
Haibo Hao,
Shuzhen Song,
Qian Wang,
Zongjun Tong,
Wen Xu,
Jinxiao Yang,
Yihong Yue,
Tingting Xiao,
Yuchen Zhang and
Hui Chen
+ 1 author
编辑推荐：
研究人员为解决高效秸秆降解菌大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)缺乏精准遗传操作工具的问题，首次成功构建了基于内源SrU6-3启动子和tRNA-sgRNA模块的CRISPR/Cas9系统。利用农杆菌介导转化(ATMT)和双重药物筛选(潮霉素/5-氟乳清酸)，成功编辑了内源ura3基因，实现了14.9%的编辑效率，为该菌株的基因功能研究与代谢工程育种提供了关键技术平台。
秸秆，这个农业生产中大量产生的废弃物，如何处理一直是个令人头疼的环保难题。然而，大自然中早已存在高效的“清道夫”——某些真菌能够将秸秆等农林废弃物分解转化。其中，一种名为大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)的食用菌表现尤为突出。它不仅能产出营养丰富的子实体，更重要的是，它拥有直接降解未发酵秸秆的“超能力”，无需高温灭菌等预处理，堪称田间地头的“微生物细胞工厂”。尽管潜力巨大，但野生菌株的自然降解效率仍难以满足现代农业废弃物的快速处理需求。想要进一步提升其“工作效能”，比如优化其木质纤维素降解酶的“工具箱”，或者重新“布线”其代谢通路，都离不开对其基因组的精准“编辑”。然而，长期以来，针对大球盖菇的精准遗传操作工具一直处于空白状态，其遗传改良只能依赖传统、费时且不精确的杂交育种方法。这成为了充分释放其作为高效降解工程菌株潜力的主要瓶颈。
为此，由Haibo Hao, Shuzhen Song, Qian Wang, Zongjun Tong, Wen Xu, Jinxiao Yang, Yihong Yue, Tingting Xiao, Yuchen Zhang和Hui Chen共同完成的研究，在《Journal of Fungi》上发表，旨在为大球盖菇构建一套CRISPR/Cas9基因编辑系统，为其未来的功能基因研究和分子育种铺平道路。
为了完成这项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，他们从中国普通微生物菌种保藏中心保藏的DQ-1菌株出发，通过原生质体单核化获得了单核菌株Y27作为研究材料。其次，他们利用生物信息学方法，从大球盖菇基因组中鉴定出了三个内源的U6小核RNA(SnRNA)启动子(SrU6-1, SrU6-2, SrU6-3)，用于驱动向导RNA(SgRNA)的表达。接着，他们构建了CRISPR/Cas9表达载体GPiE-SrU6，该载体包含了针对担子菌密码子偏好性优化的Cas9基因、潮霉素抗性筛选标记(Hyg)以及串联的tRNA-sgRNA表达模块。然后，他们建立并优化了农杆菌介导的遗传转化(ATMT)体系，将编辑载体导入大球盖菇菌丝体。最后，他们采用双重药物筛选策略，即先后使用潮霉素(Hyg)和5-氟乳清酸(5-FOA)进行筛选，并通过对靶基因ura3的测序分析来鉴定和评估基因编辑的效率。
3.1. Analysis of SrU6 Promoters in S. rugosoannulata
研究人员以人和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的U6 snRNA基因为参考，在大球盖菇基因组中进行同源性比对，鉴定出三个候选基因SrU6-1、SrU6-2和SrU6-3。序列比对分析发现，三者与灵芝(Ganoderma lucidum)的序列更相似。一个关键区别在于，仅SrU3-3的启动子区域包含经典的“TATA”框(一种真核生物启动子核心元件)，而其他两者没有。
3.2. Construction of Vectors for the CRISPR/Cas9 Gene Editing System
研究团队构建了CRISPR/Cas9表达载体。他们利用大球盖菇内源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Srgpd)启动子驱动Cas9蛋白表达，并分别用三个SrU6启动子驱动sgRNA表达以筛选最优者。验证结果表明，只有在SrU6-3驱动下才能获得突变体。因此，最终构建的载体GPiE-SrU6采用了SrU6-3启动子驱动一个串联的“tRNA-sgRNA”表达模块，靶向ura3基因的两个位点。
3.3. Establishment of the ATMT System and Screening of Antibiotic Concentrations
研究人员成功建立了针对大球盖菇菌丝体的ATMT系统。他们通过浓度测试，确定了抑制农杆菌(Agrobacterium)生长的头孢噻肟钠(Cef)浓度为600 mg/L，抑制野生型菌株生长的潮霉素(Hyg)和5-氟乳清酸(5-FOA)最佳筛选浓度分别为60 μg/mL和0.2 mg/mL。经过共培养、初级筛选(含Hyg)和次级筛选(含5-FOA)后，获得了稳定的转化子。PCR验证和实时荧光定量PCR(qPCR)分析证实了外源基因已成功整合进基因组，且多为单拷贝整合。
3.4. Identification of Mutant Strains in Transformants and Off-Target Prediction
研究人员以ura3基因(编码乳清酸-5'-磷酸脱羧酶)为靶点进行编辑验证。对筛选出的转化子进行靶点测序，发现在突变株T26和T32中，两个靶点分别发生了碱基替换，可能导致ura3基因功能失活。此外，通过对20个潜在脱靶位点进行检测，未发现脱靶事件，表明该系统具有较高的特异性。
3.5. Analysis of the Growth Phenotypes and Editing Efficiencies of Edited Strains of S. rugosoannulata
表型分析显示，ura3基因编辑成功的突变株在基本培养基(MM)上生长受到严重抑制，但在添加了尿嘧啶的培养基(PDAU)上生长可恢复，证实了其尿嘧啶营养缺陷型表型。基于87个转化子的统计，该CRISPR/Cas9系统对ura3基因的编辑效率达到14.9%。
本研究成功在大球盖菇中首次建立了一套可操作的CRISPR/Cas9基因编辑系统。核心突破在于鉴定并利用了内源SrU6-3启动子驱动sgRNA表达，结合tRNA-sgRNA串联模块和农杆菌介导转化技术，成功实现了对内源ura3基因的定点编辑，获得了尿嘧啶营养缺陷型突变株，编辑效率为14.9%。该系统展现出良好的特异性，在检测的潜在脱靶位点中未发现脱靶效应。
讨论部分进一步阐述了该研究的价值与展望。大球盖菇作为一种可直接降解秸秆的独特真菌，将其开发为高效秸秆降解工程菌株具有重要生态和农业价值。本研究建立的编辑系统为此提供了关键的遗传操作工具。研究中筛选的SrU6-3启动子含有“TATA”框，这可能是其驱动编辑成功的关键，而其他已报道的食用菌U6启动子可能缺乏此元件，这为理解不同真菌中RNA聚合酶III(Pol III)启动子的功能差异提供了线索。尽管当前编辑效率有待提高，且采用的是质粒整合的ATMT方法，但该工作为后续优化奠定了基础。未来，可探索核糖核蛋白(RNP)复合物递送等瞬时表达技术，以实现更安全、高效的编辑。最终目标是实现无标记编辑，培育出无外源基因整合、安全可商业化的食用菌品种，并利用此系统深入研究大球盖菇的子实体发育、风味物质合成及底物降解机制，充分释放其作为“微生物细胞工厂”的潜力。
