《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》：Cryo-EM visualization of partial β-sheet formation in curved transthyretin protofibrils resistant to amyloid fibril formation
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通过低温电子显微镜分析，发现酸性条件下形成的转甲状腺素蛋白原纤维具有两条4.8?间距的连续密度带，周围模糊区域，表明中心β折叠片层结构稳定，可能阻止后续淀粉样纤维形成，为早期治疗提供新靶点。
山本直树 | 森岛健 | 猪上林太郎 | 杉山正明 | 茶谷绘里
日本栃木县下束市薬师寺3311-1，自治医科大学医学部生物物理学与生理学系
摘要
转甲状腺素（TTR）形成的淀粉样纤维与多种致命的全身性淀粉样变性（ATTR）有关。前纤维状态（如原纤维）是预防临床前阶段ATTR发作的有前景的诊断和治疗靶点。然而，它们的结构特性仍知之甚少。在这里，我们利用冷冻电子显微镜技术，研究了在酸性条件下通过一种独特的体外途径形成的TTR原纤维的结构特征。二维类平均图像直接显示了沿原纤维轴分布的两条相隔4.8 ?的连续密度线，周围环绕着模糊的外层区域。这一发现表明原纤维的核心由分子间氢键稳定。部分β-折叠结构的形成可能有助于抵抗其转化为淀粉样纤维，并且也可能解释了原纤维的弯曲、柔韧形态，这与β-折叠层贯穿整个结构的淀粉样纤维不同。我们的发现揭示了不具有淀粉样形成能力的原纤维的结构特征，有助于在聚集早期阶段制定针对其β-折叠特征的治疗策略。
引言
转甲状腺素（TTR）形成的淀粉样纤维会导致全身性淀粉样变性，即转甲状腺素相关淀粉样变性（ATTR），其特征是淀粉样纤维沉积在心脏等组织或器官中。[1] 已发现多种TTR变异体可促进该疾病的发生。[2] TTR是一种四聚体蛋白，在血液中循环。其致淀粉样变性作用是通过解折叠及四聚体解离触发的，从而形成淀粉样纤维。[3],[4],[5] 使用化学化合物稳定天然四聚体结构[6]或通过siRNA减少TTR的产生[7]已在临床环境中用于治疗ATTR，但效果有限。[6],[7] 解折叠的单体TTR蛋白可能形成前淀粉样聚集体（如寡聚体或原纤维），最终导致淀粉样纤维的形成。在淀粉样纤维形成之前靶向这些聚集体是下一代治疗的一个有前景的方法。寡聚体由多个单体分子组成，其中一些可能具有细胞毒性。[8],[9],[10] 原纤维是在淀粉样纤维形成之前出现的弯曲纤维状结构。[11],[12] 此外，原纤维最近作为对抗淀粉样相关疾病的早期治疗靶点受到了关注。例如，2023年上市的首种阿尔茨海默病改良药物lecanemab就是一种针对由β-淀粉样肽1–42组成的原纤维的抗体。[13],[14] 因此，了解TTR原纤维的基本分子特性对于设计针对ATTR的治疗策略非常重要。在体外条件下，TTR在生理pH值（7.0–7.4）下非常稳定；因此，通常难以诱导其形成寡聚体或原纤维。因此，常使用酸性条件来促使四聚体结构解离，使单体结构部分或完全不稳定，从而积累这些分子[15],[16],[17],[18],[19],[20] 例如，通过电子显微镜观察到了一种TTR变异体形成了原纤维[21]。原子力显微镜也捕捉到了原纤维结构的延长[22]。小角X射线散射揭示了原纤维的结构演变[23]。另一项利用原子力显微镜的研究表明寡聚体可转化为原纤维[24]。然而，尽管对TTR原纤维进行了大量研究，其内部结构及其与淀粉样变性的关系仍不清楚。[25] 在本研究中，我们建立了一种TTR原纤维形成系统（图1），并使用冷冻电子显微镜（cryo-EM）确定了其结构。首先，我们建立了TTR原纤维的形成途径。分析超速离心（AUC）结合负染色透射电子显微镜（TEM）的结果显示，单体随机卷曲的TTR在与寡聚体形成竞争的过程中转化为稳定的原纤维（图1，左侧途径）。冷冻EM成功观察到了沿纤维轴的两条条纹。这些条纹的重复长度为4.8 ?，表明原纤维中存在通过分子间氢键稳定的β-折叠重复结构。为了验证寡聚体或原纤维是否可转化为淀粉样纤维，我们使用了淀粉样纤维种子来诱导纤维形成。结果表明寡聚体可转化为淀粉样纤维（图1，右侧途径），而原纤维则没有结构变化，这表明原纤维具有抗淀粉样转化的能力。根据冷冻EM图像获得的结构参数，我们推测原纤维由被模糊区域包围的β-折叠单元组成。
实验方法
TTR的表达与纯化
通过突变诱导TTR的表达。将含有TTR序列的pMMHa质粒导入Rosetta 2(DE3)pLysS细胞（Merck，德国）。细菌在37°C下的2 L LB培养基中培养。当OD值达到约0.7时，加入最终浓度为1 mM的异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷，并孵育过夜。离心后收集细菌并储存在-80°C。原纤维的形成
寡聚体或原纤维的形成需要非天然的分子间相互作用，因此TTR必须先解折叠才能发生这种转变。为此，我们选择了10 mM的HCl。CD光谱显示，在25°C下TTR呈现随机卷曲结构（图2A，黑线），AUC谱图中14 kDa处有一个峰值（图2B），表明TTR在10 mM HCl和25°C下处于单体随机卷曲状态。为了促进分子间相互作用，我们对样品进行了处理。讨论
在本研究中，我们利用一种独特的原纤维形成系统来观察TTR原纤维的结构。我们在酸性条件（10 mM HCl/100 mM NaCl，75°C）下追踪了TTR的大小变化。孵育开始后立即观察到寡聚体的积累（图2C、D和E）。随后，原纤维的数量呈S形增长（图2C、D和E）。冷冻EM分析显示原纤维由连续的线条组成。作者贡献声明
山本直树：撰写初稿、验证数据、资源管理、方法设计、实验实施、资金筹集、数据分析、概念构建。
森岛健：撰写、审稿与编辑、实验实施、数据分析。
猪上林太郎：撰写、审稿与编辑、实验实施、数据分析。
杉山正明：撰写、审稿与编辑、项目监督。
茶谷绘里：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金筹集、概念构建。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。致谢
冷冻EM样品制备和数据采集得到了KEK光子工厂结构生物学研究中心的川崎正人博士、池田昭人博士和仙田敏也博士的支持。冷冻EM数据分析得到了KEK的森谷敏夫博士的支持。本研究得到了AMED支持的“支持药物发现与生命科学研究平台项目（BINDS）”的资助，资助编号为JP24ama121001，资助对象为N.Y.
