法医调查遗传谱系学（FIGG）在北美、澳新大陆、欧洲和南部非洲的多个国家已被用于识别未识别人类遗骸（UHR）和暴力犯罪的实施者。一些国家的国家立法已经修改，允许使用FIGG [1]，[2]，相关的DNA谱型生成方法已经得到验证 [3]，[4]，[5]，[6]，[7]，FIGG方法已在案例研究中得到应用 [8]，[9]，[10]，或被确定为未来实施的关注领域 [11]，[12]，[13]，[14]。
为了生成适合执法部门上传到第三方遗传谱系学数据库（目前是GEDmatch PRO?和FamilyTreeDNA）的DNA谱型，主要使用了三种方法：Verogen ForenSeq Kintelligence试剂盒（QIAGEN，以下简称Kintelligence）、高密度SNP微阵列和鸟枪法测序（SGS，通常称为全基因组测序）。Kintelligence试剂盒是一种靶向大规模并行测序（MPS）试剂盒，可以扩增10,230个具有法医意义的SNP，其中大多数对亲属关系鉴定有信息价值 [15]，[16]。此外，通用分析软件（UAS，QIAGEN）可以根据欧洲、东亚和非洲参考人群提供关于样本来源（即单源或混合样本）、生物性别、表型特征（眼睛和头发颜色）以及捐赠者生物地理祖先（BGA）的信息。根据制造商的参考指南 [17]，Kintelligence试剂盒所需的最低DNA量为1 ng，最大样本体积为25 μL。然而，使用Kintelligence试剂盒的验证研究表明，即使DNA量低至0.10 ng或0.05 ng，也能获得可用的基因型 [4]，[18]。平均扩增子大小小于150个碱基对（bp），使得该试剂盒能够分析DNA降解严重的样本，并且它是专门为Illumina公司的MiSeq FGx测序仪开发的。
高密度SNP微阵列在医学诊断 [19]、[20]、[21]、生物库 [22]、[23] 和遗传谱系学领域 [24] 中得到了广泛应用。第三方消费者遗传谱系学数据库主要基于微阵列生成的DNA谱型构建 [24]。然而，历史上由于制造商推荐的DNA输入量较高（约200 ng）[25]，微阵列被认为不适合法医分析。最近的研究表明，0.2–2 ng的高质量DNA输入就足以生成适合FIGG分析的微阵列SNP谱型，甚至更少的DNA量也能生成用于近亲关系分类的谱型 [5]，[6]，[26]，[27]。迄今为止，没有证据表明细菌或真菌成分会干扰微阵列的性能 [6]。然而，DNA降解会显著影响微阵列的结果，从而影响亲属关系鉴定的准确性 [5]，[6]，[26]，[27]。
除了用于亲属关系鉴定的SNP外，微阵列还提供捐赠者的生物性别、表型和生物地理祖先信息。根据制造商的软件，通常需要较高的 calling 率（≥97%）才能自动确定性别 [28]。已有报道指出，定制的微阵列包含用于眼睛和头发颜色以及肤色预测的SNP探针，其他研究也展示了微阵列在眼睛和头发颜色推断中的应用；然而，并非所有微阵列都包含这些标记 [28]，[29]，[30]，[31]。由于第三方消费者遗传谱系学数据库基于微阵列数据构建，并提供BGA预测，因此这些阵列中必然包含用于BGA预测的SNP。这些数据库能够以惊人的精细区域分辨率预测祖先（例如波罗的海地区、英国、希腊和巴尔干地区）；然而，这种精度依赖于目前执法部门无法获得的庞大参考数据集。此外，这些预测结果以“最有可能”的形式呈现 [32]，而法医遗传学依赖于“证据权重”评估；因此，这种报告框架不适合用于法医祖先推断。
SGS涉及对样本中所有DNA分子（包括非人类DNA）的测序，并将其与人类参考基因组进行生物信息学比对以确定基因型 [33]。已经发布了适用于DNA输入量低于5 ng的SGS实验室工作流程的商业和非商业协议 [34]，[35]。此外，古代DNA研究 [36] 表明，即使使用实时PCR方法无法检测到人类DNA的样本，也能成功测序出人类DNA。如果测序片段能够与人类参考基因组可靠地对齐，SGS几乎对DNA片段大小没有下限。这使得SGS适用于高度降解样本的基因分型 [37]。此外，从测序数据中提取的基因型数量主要受数据质量限制，而非预定义的标记组合。这支持了广泛的下游分析，包括生物性别确定、表型预测和生物地理祖先推断 [33]。SGS的一个局限性是需要大型高通量测序仪器，如Illumina的NextSeq和NovaSeq，这些仪器由于高昂的采购和维护成本，在专注于应用的法医实验室中并不常见。SGS还需要受过培训的人员来进行实验室工作和数据分析，并且测序成本相对较高。
在FIGG中，与传统遗传谱系学一样，亲属关系分类依赖于个体之间共享的DNA量，以厘摩（cM）表示。总共享DNA量用于推断亲缘关系程度；例如，大约3,500 cM对应一级亲属关系，而230 cM通常对应五级亲属关系。随着亲属关系变得更加遥远，预期的cM范围扩大并在可能的亲属关系之间重叠。例如，二级表亲（五级亲属）可能共享41至592 cM的DNA，平均为229 cM，而三级表亲（七级亲属）可能共享0至234 cM的DNA，平均为73 cM [38]。随着亲缘关系的增加，每个共享DNA片段所需的信息标记数量和密度也增加，以便可靠地检测亲属关系。
研究表明，Kintelligence试剂盒能够以高置信度识别至三级亲属（例如一级表亲）[15]，并且能够检测到五级亲属（例如二级表亲）[16]，[18]，[39]。相比之下，微阵列和SGS生成的标记集更大，支持更远亲关系的检测，限制因素变成了基础遗传学而非分型平台。需要注意的是，对于七级或更高级别的亲属，真实亲属之间可能没有可检测到的DNA [38]。对于执法部门可访问的基因谱系数据库中代表性不足的人群来说，这些远亲关系尤为重要。
还必须考虑到将无关个体错误分类为七级或更高级别亲属的情况（假阳性，也称为假关联）[26]。当从含有大量环境DNA的低质量/少量样本生成谱型时，假关联的风险会增加，因为分型错误的风险也会增加 [5]，[27]。假关联可能导致大量的谱系学工作，但对案件调查没有实际价值。较长的共享片段（例如>15 cM）更可能反映近期共享的祖先关系（即基于血统的身份，IBD），而不是背景或古代共享（基于状态的身份，IBS）[40]。因此，在遗传谱系学分析中可以应用基于最长共享DNA片段的阈值来降低基于假关联构建谱系树的风险。
根据法医遗传谱系学项目 [41] 的数据，已有超过1,400起公开报告的案例（每名受害者或未识别人类遗骸一个案例）通过FIGG得到解决。瑞典和挪威使用SGS生成了用于FIGG调查的DNA谱型 [8]，[9]，Woerner等人 [7] 和Cihlar等人的出版物包括了SGS流程的内部验证研究 [42]。私人法医服务提供商已经验证了Kintelligence试剂盒在FIGG中的使用 [4]，[16]，澳大利亚联邦警察也报告了在两个未识别人类遗骸案例中使用该试剂盒 [3]。同样，基于微阵列的FIGG工作流程也得到了验证 [5]，[6]，Davawala等人还报告了使用微阵列技术对犯罪现场或未识别人类遗骸样本进行基因分型并上传到遗传谱系学数据库的情况 [27]。
尽管有许多出版物描述了这三种与FIGG兼容的分子生物学方法——Kintelligence试剂盒、微阵列分析和SGS——的使用，但据我们所知，没有研究使用相同的样本集比较它们的性能。因此，本研究的目的是使用这三种技术为十个未识别人类遗骸的试点案例生成DNA谱型，并比较所得数据集在DNA谱型质量、GEDmatch PRO?数据库上传能力和相对检测能力方面的差异。
