Complex-Up天然质谱和自上而下蛋白质组学揭示的核糖体异质性

《Journal of the American Chemical Society》：Ribosome Heterogeneity Revealed by Complex-Up Native Mass Spectrometry and Top-Down Proteomics

　　

表征大型分子机器（如核糖体）在多种生物学状态下的调控细节仍然具有挑战性。本研究开发了一种结合复合上调天然质谱（complex-up nMS）与红外多光子解离（IRMPD）和自上而下蛋白质组学（TDP）的工作流程，以实现核糖体异质性的快速直接表征。IRMPD对rRNA的优先解折叠和片段化使得能够在大肠杆菌（E. coli）不同生长状态下进行蛋白质形式分辨的核糖体异质性表征，以前所未有的细节揭示了核糖体蛋白（RP）异质性。分离的RPs的TDP表征实现了可靠的蛋白质形式表征和IRMPD谱图的便捷解读。此外，通过complex-up nMS和TDP确定的蛋白质形式相对丰度差异揭示了蛋白质形式特异性的相对相互作用强度变化。该实验框架为更快速理解核糖核蛋白异质性所赋予的多样调控机制铺平了道路，包括RP组成和翻译后修饰（PTM）异质性在调节翻译效率和特异性中的作用。

核糖体是细胞内负责蛋白质合成的大型分子机器，其组成和修饰的异质性在翻译调控中扮演关键角色。现有研究表明，核糖体异质性可增强调控能力，例如通过偏好特定mRNA、调节翻译速度和准确性，以及影响亚细胞定位。然而，直接表征核糖体在组装水平上的异质性仍面临挑战，传统方法难以同时解析其复杂的蛋白质组成、翻译后修饰（PTM）和相互作用强度。为此，研究人员开发了一种结合复合上调天然质谱（complex-up nMS）、红外多光子解离（IRMPD）和自上而下蛋白质组学（TDP）的工作流程，以大肠杆菌为模型系统，快速直接表征核糖体异质性。该研究首次揭示了不同生长状态下核糖体蛋白（RP）的蛋白质形式异质性，以及由PTM调控的相互作用强度变化，为理解核糖核蛋白异质性在翻译效率和特异性调节中的机制提供了新工具。论文发表在《Journal of the American Chemical Society》。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：①复合上调天然质谱（complex-up nMS），用于测量完整核糖体亚基及其亚复合物的质量，以识别主要物种；②红外多光子解离（IRMPD），利用10.6 μm光子优先解折叠并片段化rRNA，从而高效释放完整RP和核糖体相关蛋白（RAP），实现亚基的解离；③自上而下蛋白质组学（TDP），在变性条件下对分离的RP进行蛋白质形式鉴定，以确定其一级结构和组合修饰。样本来源包括大肠杆菌菌株B（用于初始方法建立）和菌株K12（用于不同生长阶段比较，提取自对数中期、对数后期和稳定期培养物）。

研究结果如下：

**完整核糖体亚基的质谱测量**：通过高分辨率nMS测量完整30S和50S亚基，发现每种亚基存在三种主要物种。30S亚基对应完整亚基、结合静止期诱导核糖体相关蛋白（SRA）的亚基，以及同时丢失S1和S2的亚基；50S亚基对应完整亚基、丢失L10(L7/L12₂)₂柄复合物的亚基，以及丢失L1并添加RAP RsfS（核糖体沉默因子RsfS）的亚基。这些结果揭示了亚基组成的异质性，但更精细的蛋白质形式异质性被掩盖在电荷态分布中。

**复合上调IRMPD解离核糖体亚基**：利用IRMPD对质量选择的30S和50S亚基进行解离，实现了超过60%核心RP的释放。低质荷比区域检测到丰富的RP和RAP电荷态分布，通过超高分辨率质谱进行电荷解卷积和单同位素质量测定，基于TDP鉴定的蛋白质形式进行注释，质量误差小于2 ppm。IRMPD谱图揭示了RP的PTM异质性、截短形式以及RsfS的存在。此外，通过分析蛋白质在亚基结构中的界面面积，发现释放的蛋白质丰度与界面面积占比相关，例如L9因界面面积小（占4.9%）而丰度高，而L34和L35因埋藏于23S rRNA折叠中而未被观察到。能量分辨IRMPD实验进一步证实了蛋白质释放与界面面积和相互作用强度的关系。

**生长阶段引起的蛋白质形式相对丰度变化**：研究人员比较了从大肠杆菌K12不同生长阶段（对数中期OD₆₀₀=0.22、对数后期OD₆₀₀=0.57、稳定期OD₆₀₀=1.37）分离的核糖体。通过complex-up nMS和IRMPD确定S6的C端谷氨酰化程度，发现稳定期（平均1.828个谷氨酰化）显著高于对数期（约0.74），与前期研究一致。L7:L12比例在生长过程中增加（从2.15:1到14.0:1），反映了N端乙酰化（L7）增强与L10的相互作用，增加柄复合物稳定性。与TDP结果比较，S6谷氨酰化丰度高度一致，但L7:L12比例在稳定期存在差异（TDP为49:1，而complex-up IRMPD为14:1），表明IRMPD低估了L7丰度，原因是L7的N端乙酰化增强了柄复合物稳定性，降低了释放效率。这一差异揭示了蛋白质形式特异性的相互作用强度变化，为理解翻译下调机制提供了信息。

研究结论部分总结：研究人员开发了一种结合complex-up nMS和TDP的工作流程，以大肠杆菌为模型系统直接表征核糖体异质性。然而，该方法完全可转移到真核和古菌核糖体，并普遍适用于核糖核蛋白。研究人员预计该方法将在核糖核蛋白组成表征和发现相关蛋白（如新型核糖体休眠因子）方面发挥关键作用，并提供将特定蛋白质形式与调控机制联系起来的关键生物物理信息。