减少“咖啡环效应”：通过顺序点样技术提升MALDI干滴分析法的效果

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Minimizing the Coffee Ring Effect: Improving MALDI Dried-Drop Analysis by Sequential Spotting

研究提出通过分步滴加（sequential spotting）降低滴干法（dried-drop）中咖啡环效应（coffee ring effect），从而提升质谱成像（MALDI MSI）分析的均匀性和信号强度。实验以亚油酸为分析物、9-氨基菬啶为基质，对比单次2μL滴加与分步（1μL/次或0.5μL/次）滴加的效果，发现分步滴加有效减少咖啡环和死区，提高信号一致性，但增加制备时间。

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在基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI MS）实验中，干滴分析法因其制备简便和能产生高效结果而具有价值。该方法能够评估分析物的电离能力，或判断其在MALDI激光作用下是否会发生碎片化。然而，这种技术会受到“咖啡环效应”的限制，导致干滴中出现“富集区”（分析物浓度较高的区域）和“死区”（分析物浓度极低的区域）的异质性。“咖啡环效应”发生在分析物在MALDI激光斑点边缘富集时，从而使得从样品中获取一致信号变得困难。我们发现，依次以减半或四分之一的移液体积添加干滴可以减小斑点直径，并显著增强信号强度。采用这种方法后，富集区域变得不那么明显，干滴中的死区也减少了。不过，这项研究的样本量有限，因此需要进一步探讨。尽管这种方法会增加样本制备时间，但顺序添加干滴的方式使质谱分析更加可靠，减少了死区并提高了信号强度。

引言

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<基质辅助激光解吸 电离质谱（maldi>(1,2) MALDI质谱成像（MSI）通过提供生物分子的空间和定量分布信息，进一步扩展了该技术的应用范围。(3?5)然而，在创建组织样本或球形样本的化学热图之前，(6?8)(9,10)必须先确定分析物的存在。

MALDI分析中最常用的样本制备方法是干滴法。(11?13)传统上，将样品溶液与基质溶液混合后，用移液器将混合液滴在表面上晾干，再进行质谱分析。这种方法节省时间且操作简单，能快速判断分析物的存在。但其缺点是“咖啡环效应”，(17?23)会导致分析物分布不均和基质结晶不均匀，从而影响定量结果的准确性。干滴中的分析物会集中在斑点边缘，形成类似咖啡杯留下的环状结构。(24) 依次添加少量液体（分多次进行）并在每次添加后让液体干燥，是替代一次性加入全部液体的方法。本研究中，以亚油酸（必需脂肪酸）作为分析物，9-氨基吖啶（9-AA）作为基质，通过依次添加干滴来优化方法，以减少咖啡环效应。通过MALDI-MS成像和后续统计分析，比较了依次添加干滴与传统方法的效果。

方法

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<在这项实验中，将5 mg ml的9-aa（丙腈 水，75:25，v v）溶液与200 μml的亚油酸（甲醇）溶液按1:1的比例混合。9-aa呈鲜艳的黄色，使得干滴在透明载玻片上易于识别。分析了三滴样品，每滴总体积为2 μl：第一滴一次性加入2 μl，第二滴分两次各加入1 μl，第三滴分四次各加入0.5 μl，每次添加后让样品干燥5分钟。每种条件重复七次，其中六次为技术重复实验，另一次在另一天进行。还分析了一滴单独的对照样品（ctrl），其中仅含有9-aa基质。对照样品也分三次添加，每次体积相同，每次添加后干燥5分钟。样品滴在三层氧化铟锡（ito）涂层的载玻片上，并在bruker timstofflex仪器上以负离子模式进行分析，扫描范围为200–1200 m>选择ITO载玻片是因为它们在MALDI成像中应用最广泛。此外，在ITO载玻片上可以使用移液器将样品均匀分布。在非ITO涂层区域用记号笔标记圆圈，以便在添加样品时定位。从每个斑点的相同位置收集质谱数据，并根据理论时钟位置进行标记。首先在10点、2点、4点、8点和中心位置采集数据。收集完数据后，使用MALDI-MSI对干滴进行完整成像（图1A和1B）。仪器参数如下：每次发射500次脉冲，频率为10,000 Hz，激光功率65%，光束扫描范围20 μm × 20 μm，激光呈“蛇形”路径扫描。

图1

图1. 依次添加干滴的实验流程：(A) 包括制备含9-AA和亚油酸的干滴溶液，并通过MALDI-MSI进行分析。(B) 在干滴上叠加了理论时钟面，数据按此时钟面进行解析。每个位置分别在10点、2点、4点、8点和中心位置采集样本。n = 5。(C) MALDI-MSI捕获的图像。亚油酸（279.2332 m/z）用橙色表示，9-AA峰（385.144 m/z）用蓝色表示。SMART报告标准：(25) (S) 16 μm × 16 μm；20 μm（光束扫描设置）；CTRL 2 μL：39263次扫描，CTRL 1 μL：21661次扫描，CTRL 0.5 μL：13618次扫描，2 μL：17944次扫描，1 μL：21205次扫描，0.5 μL：12652次扫描；(M) MS1–0.88 ppm；(A) 目标峰；(R) 4000（基于亚油酸峰计算）；(T) 平均时间约30分钟/感兴趣区域。(D) 从收集到的质谱数据中计算平均值和标准偏差。

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结果与讨论

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<在图1c中，亚油酸用橙色表示，基质峰用蓝色表示。图1c显示，一次加入2 μl的样品出现了明显的咖啡环效应。相比之下，分四次各加入0.5 μl的样品则更加均匀，没有咖啡环效应，分析物和基质分布更均匀。数据表明，从一次加入2><首先，随着添加体积从2 μl减少到0.5>^补充表1中的数据所示，1 μL + 1 μL和0.5 μL + 0.5 μL + 0.5 μL的组合比一次加入2 μL的样品信号强度更高。尽管各组样品中的分析物总量相同，但添加方式的不同导致了显著差异。^补充图1还显示，干滴中的“死区”（分析物浓度较低的区域）减少了，从而更容易找到富集区。<虽然依次添加样本可以提高干滴的均匀性和信号强度，但需要注意的是，这会增加样本制备时间，因为每次添加后需要等待样品干燥。如果使用标准的2 μl添加量，每次添加2 μl或4 × 0.5>

结论

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<干滴法是一种简单高效的maldi成像实验起始方法，但当目标分析物形成咖啡环或死区时会出现困难。解决这一问题的方法是增加添加次数并减少每次添加的液体体积，从而减少咖啡环效应并简化分析过程。对于9-aa基质和亚油酸分析物，可以通过增加添加次数并减少每次添加的体积来保持浓度均匀，从而减少咖啡环效应。这项初步验证研究表明，将移液体积降至1 μl或0.5 μl可以提高干滴的均匀性和信号强度。通过提高每次添加的精度，减少了寻找富集区的必要性，提高了分析结果的准确性和可靠性。由于所用仪器能够检测到难以追踪的分析物，因此增强了实验的可靠性。为避免寻找富集区或处理死区带来的麻烦，发现多次添加样本（每次2 μl或4 × 0.5>