基于云的原生地球观测技术在定量植被科学中的应用：架构、工作流程及科学意义 Jochem Verrelst, Emma De Clerck, Bhagyashree Verma, Kavach Mishra, Gabriel Caballero

《Remote Sensing》：Cloud-Native Earth Observation for Quantitative Vegetation Science: Architectures, Workflows, and Scientific Implications Jochem Verrelst, Emma De Clerck, Bhagyashree Verma, Kavach Mishra and Gabriel Caballero

　　摘要
不定根的形成在植物的无性繁殖中起着关键作用，然而关于辣椒这一过程的研究仍然有限。外源生长素处理显著促进了辣椒不定根的形成，我们鉴定出CaLBD16是生长素信号传导下游的一个正向调节因子。进一步分析表明，生长素向CaLBD16的信号转导是通过激活CaARF6和CaWOX11来介导的，这两种因子也都参与不定根的形成。综上所述，我们的发现揭示了辣椒中由生长素诱导的不定根形成的分子机制，为其在生产中的实际应用提供了宝贵的见解。

1. 引言
不定根（AR）起源于非根组织，其形成是扦插繁殖的关键步骤[1]。通过扦插进行克隆繁殖可以传递抗虫或抗病性状。多种激素影响不定根的形成，包括生长素、乙烯、茉莉酸和细胞分裂素[2,3,4,5]，这表明该过程非常复杂。其中，内源性生长素起着最关键的作用，并且被广泛用于组织培养中诱导生根[6]。在生理水平上，IAA逐渐在伤口处积累，从而促进不定根的形成[7]。外源IAA处理可以刺激韧皮部细胞的分化，形成单向的内源性生长素通道，有助于不定根原基的启动[4]。在分子水平上，生长素的生物合成、运输和信号传导通过与关键基因的激活紧密相关。这些关键基因包括生长素生物合成基因如AtYUC2和AtYUC6；生长素转运蛋白如AUX1、LAX3[8]和PIN1[9]；以及生长素响应因子如ARF4、ARF6/8和ARF7[10,11,12]。此外，生长素/吲哚-3-乙酸（Aux/IAA）家族成员——包括IAA4[13]、IAA14[14]、IAA13和IAA16[15]——已被证明参与不定根的形成调控。不定根的形成涉及细胞命运的改变，而在这一过程中WOX基因家族起着关键作用。WOX11调节从具有再生能力的细胞到根原基的第一步，而下游激活的WOX5则控制从根原基到不定根原基的过渡[10,16]。在拟南芥中，AtWOX11和AtWOX5的表达在生长素的作用下被诱导[16]。此外，LBD基因家族的成员也被证明对不定根的形成至关重要。特别是LBD16/29、LBD18和SBRL在不同物种中都参与了这一过程，其中LBD16和LBD29被认为是WOX11的直接下游靶标[4,17,18]。
辣椒（Capsicum annuum）是一种全球重要的蔬菜作物，但许多优良品种的不定根形成能力较弱，这限制了其通过扦插的有效繁殖。尽管生长素已知能促进多种植物的不定根形成，但在辣椒中的作用及其背后的分子机制仍完全未被探索。鉴于辣椒茎的木质化特性以及缺乏关于其新根器官发生的研究，识别调控生长素诱导不定根形成的关键因素至关重要。阐明这些机制不仅将加深我们对辣椒根发育的理解，还为提高商业生产中的扦插繁殖效率提供理论基础。

在这项研究中，我们发现CaLBD16在新根器官发生中起着关键作用。值得注意的是，外源生长素处理显著促进了辣椒不定根的形成。我们还证明了CaARF6介导生长素信号传递以激活CaLBD16的表达。除了这一典型的生长素信号传导途径外，CaWOX11也被发现对生长素有反应并激活CaLBD16的转录。总的来说，这些发现表明调控不定根形成的调控框架在植物物种间相对保守，并为改善辣椒中的不定根形成提供了理论基础。

2. 结果
2.1. 外源IAA显著促进了辣椒不定根的形成
为了研究辣椒中的不定根形成，我们选择了广泛种植但难以生根的S8品种作为实验材料。将两周大的组织培养幼苗剪下并转移到基础MS培养基或添加了1 mg/L IAA的MS培养基中，并在10天内记录表型观察结果。经过10天的处理后，在含IAA的培养基上培养的的外植体产生的不定根数量是对照组的大约八倍（图1A,B）。此外，在IAA处理下，不定根在第5天就已经出现，而在对照组中，不定根直到第7天才出现（图1C）。
2.2. CaLBD16的过表达显著促进了番茄不定根的形成
S8品种的子叶用1 mg/L IAA处理，并通过qRT-PCR分析检测CaLBD16的表达，后者是一种已知在多种物种中促进不定根形成的关键转录因子[4,17,19]。结果表明，CaLBD16的表达在外源IAA处理后显著上调（图2A）。亚细胞定位分析进一步显示CaLBD16定位于细胞核（图2B），与其作为转录因子的预期作用一致。CaLBD16基因被克隆并引入番茄中过表达，产生了三个独立的转基因株系（图2C）。将这些株系的两周大组织培养幼苗进行扦插繁殖，并记录不定根的数量。与野生型（WT）相比，所有三个过表达CaLBD16的株系都表现出显著增强的不定根形成，每个外植体平均产生约4个不定根，而WT仅为约2个（图2D,E），表明CaLBD16在促进不定根形成中的作用在植物物种间是进化保守的。
2.3. CaARF6激活CaLBD16
已知ARF转录因子在不定根形成中起重要作用。为了研究辣椒中的CaARF6是否对生长素有反应并参与这一过程，我们首先检查了其在IAA处理下的表达情况。结果表明，CaARF6的表达模式与CaLBD16相似，在生长素作用下显著上调（图3A）。亚细胞定位分析表明CaARF6定位于细胞核（图3B），与其作为转录因子的作用一致。
2.4. CaARF6的过表达显著促进了番茄不定根的形成
将35S:CaARF6构建体引入番茄，成功获得了三个独立的转基因株系（图4A）。将CaARF6-OE株系的两周大子叶从基部剪下并转移到新鲜的MS培养基中以诱导生根。在CaARF6-OE株系中，5天时就观察到了根的出现，而在WT植物中，不定根直到6天才出现（图4B）。随后的定量分析显示，CaARF6-OE株系产生的不定根数量显著多于WT，每个植物平均产生约4个根，而WT仅为约2个（图4C,D）。这些结果表明CaARF6促进不定根的形成。
2.5. CaWOX11激活CaLBD16
鉴于CaLBD16的启动子包含与苹果中报道的WOX11结合元件相同的TTAATGG序列[4]，我们研究了CaWOX11是否在辣椒中调控CaLBD16。首先，表达分析显示CaWOX11在IAA处理下显著上调（图5A），这与CaLBD16的表达模式一致（图2A）。在烟草叶片中的瞬时过表达实验表明CaWOX11定位于细胞核（图5B），与其作为转录因子的作用一致。
2.6. CaWOX11的过表达显著促进了番茄不定根的形成
在番茄中过表达CaWOX11基因，成功获得了三个独立的转基因株系（图6A）。将CaWOX11-OE株系的两周大组织培养幼苗的子叶从基部剪下并转移到新鲜的MS培养基中。结果显示，CaWOX11-OE株系产生的不定根数量是WT的两倍多（图6B,C），并且不定根的出现也更快（图6D）。CaWOX11促进不定根的形成。(A) 通过qRT-PCR鉴定了三个过表达CaWOX11的番茄品系。(B) 与野生型(WT)相比，观察过表达CaWOX11的番茄插条中的不定根形成情况。(C) 对(B)中不定根形成的定量分析。(D) 在9天内，过表达CaWOX11的番茄插条的生根率与(B)中的WT进行了比较。数据为平均值±标准误差[n = 3 (A)，n = 15 (B–D)]，n代表生物学重复次数。差异(** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001)基于双尾Student’s t检验。

3. 讨论
不定根的形成是无性繁殖中的一个关键步骤，是无土栽培作物扩繁的重要手段。不同辣椒品种之间的不定根形成能力存在显著差异，这突显了了解该物种潜在分子机制的重要性。不定根的形成是由于生长素的极性运输产生的，这种运输建立了生长素梯度，随后在生长素刺激下导致根原基细胞的分化。外源生长素只能通过提供短暂脉冲效应来模拟内源生长素的作用。本研究调查了外源生长素处理在模拟辣椒中促进不定根形成过程中的作用，并阐明了生长素信号传导途径与不定根形成之间的联系[20]。越来越多的证据表明，生长素可以促进多种植物物种的不定根形成，包括拟南芥[21]、水蕨[22]、小叶榆[3]、番茄[23]、甘薯[24]和黄瓜[25]。与这些发现一致，我们在辣椒中的实验也显示生长素可以增强插条繁殖过程中的不定根形成（图1）。这表明生长素在促进不定根形成中的作用可能在整个植物界中是保守的。

LBD转录因子已被证明参与多种植物器官的发育，包括侧根[17]、花[26]和叶[27]。该家族中的几个成员也已知调节不定根的形成，如LBD16/29[28]、LBD17[18]和LBD18[17]。其中，LBD16已被报道在多种物种中控制不定根的形成，包括拟南芥、桃[29]、杨树[30]和玉米[31]。然而，LBD16在辣椒中的作用尚不清楚。在这项研究中，我们在番茄中过表达了CaLBD16，并观察到其显著促进了不定根的形成。此外，CaLBD16的表达在IAA处理后上调，表明IAA诱导CaLBD16增强了辣椒中的不定根形成（图2）。生长素在辣椒中调节CaLBD16的信号通路需要进一步研究。ARF转录因子作为生长素信号传递的关键介质，在多种物种中都与不定根的形成有关。值得注意的是，研究表明ARFs最终通过激活LBD16来发挥其功能，如在桃[29]和杨树[30]中观察到的那样。在这项研究中，我们在CaLBD16启动子中鉴定出了一种典型的ARF结合基序(TGTCTC)，并通过实验验证了CaARF6是直接的上游调节因子（图3）。此外，表型分析证实CaARF6促进了不定根的形成（图4）。

新的不定根形成需要细胞命运的转变，这一过程中WOX11和WOX5已被证明起关键作用[16]。这些因子随后通过激活LBD16来促进不定根的形成[32]。在苹果和拟南芥中，WOX11结合元件被鉴定为TTAATGG[4,10]。CaLBD16的启动子分析显示该元件位于起始密码子相对位置-194 bp处。实验验证确认CaWOX11调节了辣椒中的CaLBD16表达。值得注意的是，与苹果和拟南芥中报道的元件位置相比，这一基序在辣椒中更接近起始密码子，表明可能具有更强的调控效果。尽管生长素在促进不定根形成方面的作用被广泛认可，但其在辣椒中的具体功能尚未得到详细研究。我们的研究表明，外源IAA是促进辣椒中不定根形成的关键激素。此外，我们阐明了一条在其他物种中也存在的调控途径——机械损伤通过生长素激活诱导不定根的形成，这一过程由CaWOX11和CaARF6介导，CaLBD16是其核心。这些发现为提高辣椒生产的生根效率提供了理论基础，并为培育更适合扦插繁殖的品种提供了宝贵的见解。

4. 材料与方法
4.1. 植物材料与处理
辣椒S8的种子经过表面消毒后，播种在1/2 MS培养基（Coolaber，北京，中国）上。两周后，切除下胚轴的基部部分，并转移到添加了1 mg/L IAA（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，美国）的MS培养基中进行继代培养。番茄种子也进行了类似的消毒处理，并在添加了1.5%（w/v）蔗糖并固化了0.8%琼脂的1/2 MS培养基上发芽。两周后，切下基部下胚轴段，并将其转移到添加了3%（w/v）蔗糖和0.8%琼脂（含1 mg/L IAA）的MS培养基上进行继代培养，同时也转移到不含激素的MS培养基上。所有植物材料都在无菌生长室中维持，在控制条件下培养：昼夜温度为26/23°C，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，光照强度为144 μmol/m2/s。两周大的S8幼苗的下胚轴用含有1 mg/L IAA和0.1%（v/v）Triton X-100（Solarbio，北京，中国）的溶液处理。处理后0小时、3小时和6小时分别从下胚轴中取样，立即在液氮中迅速冷冻，并保存在-80°C直到RNA分离。每个生物学重复实验由五株植物的组织混合而成，每个时间点收集三个独立重复样本。

4.2. 转基因过表达构建
研究了在35S启动子控制下过表达CaARF6、CaWOX11和CaLBD16的效果。这些基因的全长编码序列从辣椒S8中扩增并克隆到pHellgate 8载体中。然后通过Agrobacterium rhizocarpus介导的转化将构建体导入番茄植株中，使用的转化菌株为GV3101。转基因植株通过PCR分析得到确认，转基因表达水平通过RT-qPCR确定。

4.3. RNA分离与表达分析
使用SteadyPure Plant RNA提取试剂盒从冷冻组织样本中分离总RNA。大约1 μg的RNA用HiScript II 1st Strand cDNA合成试剂盒（Vazyme，南京，中国）逆转录成cDNA。定量实时PCR（qRT-PCR）在Roche LightCycler? 480系统（Roche Diagnostics，巴塞尔，瑞士）上进行，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京，中国）在96孔板上进行。内参基因（Caz06g27840/Solyc11g005330.1）用于检测[33]，所有引物序列见表S1。

4.4. 细胞内定位
CaARF6、CaWOX11和CaLBD16的编码序列（不包括终止密码子）被插入到35S::pCAMBIA1300-GFP载体中。所得构建体及空载体通过Agrobacterium rhizogenes菌株GV3101与核标记AtHY5-mCherry一起导入Nicotiana benthamiana叶片中。使用Zeiss LSM510 META共聚焦显微镜（Carl Zeiss，Oberkochen，德国）观察荧光，GFP的激发/发射波长为488/510 nm，mCherry的激发/发射波长为561/610 nm。

4.5. 酵母单杂交测定
CaARF6和CaWOX11的全长编码序列被插入pGADT7载体中。CaLBD16启动子的串联三重复序列（AAGCCATTAATAA或AAATGTCTCCTA）经过BstBI（New England Biolabs，Ipswich，MA，美国）消化后克隆到pAbAi bait载体中。所得构建体被线性化并整合到酵母Y1H Gold（WeiDi Biotechnology，上海，中国）基因组中以生成报告菌株。这些菌株随后在SD/-Leu/-Ura培养基（Coolaber，北京，中国）上28°C培养72小时。阳性菌落用蒸馏水重悬至OD600为0.2，并将其分装在含有或不含aureobasidin A（AbA）（Coolaber，北京，中国）的SD/-Leu/-Ura平板上。与空pGADT7和pAbAi-CaLBD16共转化的酵母细胞作为阴性对照。

4.6. 双荧光素酶激活测定
对于结合活性测定，将每个目标基因起始密码子上游2000 bp的启动子片段克隆到pGreen II 0800-LUC载体中作为报告基因。该载体还包含一个由35S驱动的Renilla luciferase（REN）盒作为内部对照。CaARF6和CaWOX11的全长编码序列被插入pGreen II 62-SK载体中生成效应菌株，而空62-SK载体作为阴性对照。所有构建体均转入Agrobacterium tumefaciens GV3101中。适当的农杆菌菌株组合混合后共注射到Nicotiana benthamiana叶片中。三天后，叶片喷洒 Luciferin并使用CCD相机（例如NEWTON 7.0 Bio，Vilber，Marne-la-Vallée，法国）捕捉图像。萤火虫和Renilla萤光素酶的活性通过双荧光素酶测定试剂盒（Promega，Madison，WI，美国）进行定量。

补充材料
以下支持信息可下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/plants15081188/s1，表S1：本研究中使用的引物。