病毒介导的棉花基因同步沉默与编辑系统 Yufeng Zheng, Lianjia Zhao, Yulin Tian, Jiahao Lin, Xiaodong Liu and Jianfeng Lei

《Plants》：Virus-Mediated System for Simultaneous Gene Silencing and Genome Editing in Cotton Yufeng Zheng, Lianjia Zhao, Yulin Tian, Jiahao Lin, Xiaodong Liu and Jianfeng Lei

　　

植物病毒载体是外源基因瞬时表达的有力工具，不仅可用于病毒诱导基因沉默，还可用于病毒诱导基因组编辑。然而，目前鲜有报道能够在棉花中同时实现基因沉默和基因编辑的技术系统。因此，开发一种能够同时介导基因编辑和基因沉默的病毒载体系统，将为推进棉花功能基因组学研究和分子设计育种提供一个有价值的平台。为解决这一空白，研究人员在棉花中建立了一个可同时实现基因沉默和基因编辑的系统。该系统以过表达Cas9的棉花作为受体，并以棉皱叶病毒和烟草脆裂病毒作为载体，靶向GhCLA1基因。该基因在沉默和突变时会产生白化表型。起初，研究人员分别使用CLCrV和TRV作为基因编辑和基因沉默的载体。然而，结果表明，通过TRV可以实现对GhCLA1基因的持续性沉默，但通过CLCrV未能实现系统性的基因编辑，这表明CLCrV和TRV在同时作用时可能存在病毒交叉保护。随后，研究人员在TRV和CLCrV载体中串联组装了GhCLA1沉默片段和sgRNA表达元件，成功地实现了基因沉默和编辑，尽管编辑效率较低。通过缩短基因沉默片段进一步优化后，编辑效率显著提高了2.61至3.11倍，同时仍保持了有效的GhCLA1沉默。这个优化后的系统为棉花基因编辑提供了一个强有力的工具。

病毒介导的棉花同步基因沉默与基因组编辑技术研究

一、 研究背景与目的

植物病毒载体，如烟草脆裂病毒和棉皱叶病毒，是进行外源基因瞬时表达、实现病毒诱导基因沉默和病毒诱导基因组编辑的有力工具。然而，由于植物固有的抗病毒基因等因素的干扰，病毒介导的编辑系统在应用中存在局限性，例如难以在棉花等作物中高效实现系统性感染和可遗传的基因组编辑。特别是，能够利用同一病毒载体系统在棉花中同时实现基因沉默与基因编辑的技术平台此前鲜有报道。构建这样一种同步操作技术体系，对于深入理解植物抗病毒机制、优化VIGE效率以及推动功能基因组学研究与分子设计育种具有重要意义。为此，本研究旨在探索并建立一套基于CRISPR/Cas9的病毒载体系统，以实现棉花中目标基因的同步沉默与编辑。

二、 研究概述与意义

本研究以稳定过表达Cas9的Cas9-OE棉花为材料，选用棉皱叶病毒和烟草脆裂病毒作为载体，以能产生白化表型的GhCLA1基因为视觉报告基因，同时以干旱胁迫负调控因子GhAGL16为靶点，构建了一系列病毒载体。研究人员成功开发了一套病毒介导的同步基因沉默与编辑系统，并通过对沉默片段长度进行优化，显著提升了编辑效率。该研究为在棉花中高效进行基因功能分析提供了一个实用且高效的技术工具，也为解决病毒交叉保护、提高VIGE在顶端分生组织中的效率等问题提供了新的思路。该研究成果已发表在学术期刊《Plants》上。

三、 关键技术方法简述

本研究采用了几项关键的实验技术。首先是病毒载体构建，以CLCrV-A和TRV-V2为基础骨架，分别构建了仅携带sgRNA、仅携带基因沉默片段以及串联携带两者的多种重组载体。其次是农杆菌介导的瞬时转化，将构建好的病毒载体质粒转入农杆菌GV3101，通过共浸润法接种到具有两片完全展开子叶的Cas9-OE棉花幼苗上。再者，研究人员利用定量聚合酶链式反应对系统性叶片中GhCLA1基因的表达水平进行了检测，以评估基因沉默效果。在突变检测方面，采用了PCR/限制性内切酶分析和Hi-TOM高通量测序技术，对靶基因的编辑效率进行定性和定量分析。最后，通过统计方法对基因表达差异和编辑效率进行了显著性分析。

四、 研究结果

3.1. 两种植物病毒同时实现GhCLA1基因沉默与编辑的可行性验证

研究人员设计了四组对照实验，分别将携带不同元件的CLCrV与TRV载体组合接种到棉花幼苗上。结果显示，同时接种CLCrV-GhCLA1-sgRNA与TRV:GhCLA1i的组别，其系统性叶片出现了显著的白化表型，qPCR分析也证实了GhCLA1表达被显著抑制。然而，尽管在接种的子叶中检测到了GhCLA1基因的编辑事件，在系统性叶片中却未检测到CLCrV介导的编辑，且只积累TRV病毒。这表明，在同一植株中，TRV介导的沉默能够系统发生，而CLCrV介导的编辑则未能系统性实现，提示两种病毒间可能存在交叉保护效应。

3.2. 棉花中串联基因沉默与编辑系统的建立

为了克服病毒交叉保护的问题，研究人员构建了将GhCLA1沉默片段与靶向GhCLA1或GhAGL16的sgRNA串联组装到同一TRV或CLCrV载体中的系统。接种实验表明，通过TRV和CLCrV递送这种串联载体的植株，在系统性叶片中均观察到了预期的表型变化（白化或黄化）以及GhCLA1表达的下调。通过PCR/RE和测序，研究人员在系统性叶片中成功检测到了GhCLA1和GhAGL16靶位点的多种类型突变，证明了利用同一病毒载体实现同步基因沉默与编辑的可行性。

3.3. 基因编辑效率评估

研究人员通过高通量测序定量评估了串联系统的编辑效率。结果显示，对于GhCLA1和GhAGL16，无论是通过TRV还是CLCrV递送，在系统性叶片中均检测到了编辑事件，但效率相对较低，范围在~2%至~15%之间。统计分析表明，两种病毒载体对同一靶基因的编辑效率无显著差异。

3.4. 不同沉默片段长度对基因沉默和编辑效率的影响

为了进一步提升编辑效率，研究人员假设缩短载体中外源片段的长度可能有利于病毒的复制和移动。他们克隆了更短的GhCLA1基因沉默片段，并构建了相应的串联载体。实验发现，长度为282bp的片段无法有效诱导基因沉默，而长度为368bp的片段则能有效沉默GhCLA1。更重要的是，与使用431bp片段的系统相比，使用368bp片段时，无论是TRV还是CLCrV介导的系统，其GhCLA1基因编辑效率均得到了显著提升，分别提高了约3.11倍和2.61倍。这证明优化沉默片段长度是提高同步系统编辑效率的有效策略。

五、 讨论与结论

在讨论部分，研究人员指出，实现可遗传编辑的关键是将CRISPR组件高效递送至茎尖分生组织或生殖细胞。本研究建立的同步系统，通过在同一载体中整合沉默和编辑元件，简化了实验流程，并规避了不同病毒载体间可能存在的交叉保护问题。该系统为研究植物抗病毒基因与VIGE的相互作用机制提供了有力工具，例如可通过替换沉默片段来靶向沉默特定的抗病毒基因，从而可能促进病毒的系统性移动与积累，最终提高基因组编辑效率。该系统的设计原理也有望推广至其他遗传转化困难的作物。

本研究的局限性包括：对于异源四倍体棉花，如何同时编辑A、D亚基因组中的多个基因拷贝仍具挑战；此外，植物病毒载体的运载能力有限，目前仍需依赖稳定的Cas9-OE受体材料。未来，更小尺寸的核酸酶（如Cas12e, Cas12j, Cas12f）的开发可能有助于突破这些限制。

研究结论：在本研究中，研究人员建立了一个利用病毒载体在棉花中同时进行基因沉默和编辑的技术框架，为病毒递送系统的优化提供了实用见解。